提起细胞培养，污染是一个没有办法绕过去的问题。除了支原体污染，还有一种是大家都听过，都觉得自己经历过，但大家都说不清是什么东西的污染，那就是所谓的“黑胶虫”污染。

说到“黑胶虫”污染是什么，大家都说不清，【CELLCOOK赛库生物】整理并分析了网上的说法：

“黑点”主要分为两大类：一类是生物，一类是非生物。

先来看生物类

01 原虫

这个就是最开始的，也是传说中的那个“黑胶虫”的来源。翻查文献，的确找到两篇中文文献与此相关，具体名字为：“牛血清中新发现一种对细胞培养有害的微生物”[1]，发表于1988年，发表杂志为《中国畜禽传染病》；另一篇为：“牛血清中发现一种对细胞培养有害的单细胞生物”[2]，发表于1991年，杂志为《中国畜牧杂志》。两篇文献可能受限于当时的研究状况，或者文章发表的惯例，通篇没有方法与结果，有的只是语言描述，完全不清楚是如何开展的实验及如何得出具体的结果的。根据文章里的描述，单纯的血清就能观察到这种“胶原虫”，且37℃放置一个月可见明显沉淀，显示该“胶原虫”增殖缓慢，明显不是细菌或真菌，常规消毒灭菌方法均耐受暗示该“原虫”不是生物体，而是蛋白或钙盐沉淀一类的颗粒物。另外，根据CNKI的搜索结果，这两篇文献均没有被引用，也没有找到后续研究，按现在网上找到的说法，是当时没有研究经费，项目没有继续下去。但根据两篇文献里的描述，该“原虫”可以耐受高温灭菌，紫外照射，常规消毒剂处理和辐照，绝对是水熊虫级别的发现，但30年过去，以现在科研经费的情况，竟然没有任何的跟进研究，这不能不说是很可惜的，或者说是很明智的。

02 纳米细菌

这个多见于国外的文献，名字为nanobacteria。同样在1988年，由芬兰科学家在细胞培养液中发现。该“细菌”表面覆盖有钙化外壳，能耐受高温和强酸。后在各种疾病中发现，如肾结石、胆结石、动脉斑块等。但后续实验发现该“细菌”不含有DNA和RNA，且其行为方式与碳酸钙颗粒高度相似。最后被认定为非生物体[3]。

03 支原体

支原体在光镜下不可见，原则上在光镜下观察到的“黑点”不可能是支原体。但不能排除细胞感染支原体之后，细胞状态受到影响，状态不佳导致细胞碎片增多。而且随着支原体感染程度加深，细胞状态变得更差，碎片增多，黑点增多，导致“黑胶虫”感染加深的错觉。这种情况下，使用针对支原体的抗生素可以减轻细胞所受的影响，碎片减少，所谓“黑胶虫”的污染情况得到改善。

04 细菌/真菌

根据2010年发表的一篇文献，作者在其细胞培养液中分离了里面的“黑点”，检测了其中的核酸，并测序做了聚类分析，证实了其培养液中的黑点是一种无色杆菌[4]。按此推测，只要在形状上相似而且可在细胞培养基中生长的细菌或真菌均有可能会被当成是所谓的“黑胶虫”。但细菌或真菌与细胞间是共用培养环境，是竞争关系，才会出现网传的细胞状态好，黑点少的现象。但细菌/真菌的污染一般都会快速令培养液变黄变浑浊，或产生沉淀等较明显感染现象。且可通过16S/18S的检测分辨具体感染的菌株。这时候，对应的抗生素是可以快速有效杀灭此类污染，如前面提到的无色杆菌，作者正是使用了环丙沙星/哌拉西林对症处理，快速消除污染。这两种抗生素估计就是现在市场上推销的所谓“黑胶虫清除试剂”的主要成分（可能还加入了抗真菌药物）。但正如前面提到的，有可能不同操作者的黑点是不同种的细菌或真菌，上述的抗菌药物不一定能有效杀灭，且长期使用抗生素同样会对细胞产生毒副作用，细胞状态难以恢复。

介绍完生物类，接下来介绍非生物类

01 二氧化硅颗粒

早期细胞培养用玻璃培养瓶，可能有二氧化硅颗粒，但应该是一过性的，不会持续产生。且现在大多用塑料的一次性培养瓶，应该不会再产生类似问题。

02 细胞碎片

细胞在衰亡时会产生的凋亡小体等碎片，而当细胞状态变差时，所产生的碎片也会增多。这样会容易产生一种“黑点”增多导致细胞状态变差的错觉。相反，如此时及时换液或调整细胞状态，细胞状态好了，衰亡产生的碎片自然减少，从而产生了一种“黑点”与细胞竞争的错觉，从而误断“黑点”是一种污染。如果细胞只是单纯的因为没有及时换液，或者所用培养基不合适等单纯培养条件导致的细胞状态变化产生的“黑点”，使用抗生素是没有作用的；但如果是支原体等污染导致的细胞状态变差，使用针对性的抗生素治疗，是可以使细胞状态变好，“黑点”减少的。

03 钙盐颗粒/蛋白沉淀

血清成分复杂，含有各种的离子，蛋白。冻融的过程会让一部分变性的蛋白在缺少伴侣蛋白的作用下无法完全复性，从而形成沉淀析出。这就是血清中“黑点”形成的部分原因。国外血源的质量相对较好，且取血过程相对成熟稳定，血清中的蛋白析出较少，“黑点”较国内血清要少，这就是“国内血清相对较脏”说法的来源。而热灭活的过程会促使蛋白质变性，产生沉淀，形成更多的“黑点”。培养基或血清在37℃下放置，钙离子会产生诸如碳酸钙、磷酸钙等沉淀，蛋白质也会析出或形成沉淀，从而产生更多“黑点”，产生“黑点”增殖的假象。但这个过程相对缓慢，就会产生“胶原虫”文献里出现的37℃放置一个月后观察到沉淀的现象，而不是一周或两周就产生明显的沉淀。

以上就是网上能找到的说法的综合分析。不难发现，所谓的“黑点”，要不就是不太常见的细菌或者真菌污染，要不就是细胞状态不好等情况产生的细胞碎片或者是蛋白和钙盐等的沉淀。而所谓的“黑胶虫”，可能是受当时研究或观察手段所限，或对一些现象观察后思考不周，没有严格验证而所产生的错误结论。正如这里总结的，不同的培养者遇到的“黑点”可能都是不一样的，或污染或碎片，但就因为都是一些黑色的颗粒，就将其简单地归为那虚无缥缈的“黑胶虫”，这是非常缺乏科学精神的行为，也非常不应该出现在科研工作者身上的。相反，我们应该对出现了“黑点”的细胞进行仔细的分析，认真找出导致“黑点”产生的真正原因。才能真正的解决“黑点”的问题，减少“黑点”出现的频率。

这里，我们给出一点思路：
“黑点”的出现是系统性的还是只是在个别细胞身上？如果是前者，考虑是否共用的试剂出现污染还是品质出现问题；如果是后者，则考虑细胞的培养条件是否合适，或者是否污染。
而对于疑似的污染，可尝试富集“黑点”后提取DNA，扩增16S或18S基因并测序，比对后确认污染的是什么菌，并对症治疗。而不是随便在外面买个所谓的“黑胶虫清除试剂”一通乱加，这才是对细胞最好的处理。

以上，在“黑点”出现的时候，你真的了解你的细胞经历了什么了吗？