养iPSC的小伙伴们，是否每次传代看到那些珍贵的克隆都如履薄冰？消化轻了，细胞团下不来；消化重了，细胞活率直线掉... 别担心！这份超实用的iPSC细胞消化Q&A，帮你扫清操作盲区，让传代变得轻松又高效！

1. iPSC为什么要特别小心消化？它们和普通细胞系有什么不同？
关键在于iPSC的“娇贵”特性！
集落生长：它们通常长成紧密的克隆团，不像贴壁细胞那样均匀分散。
细胞间连接强：iPSC之间通过E-cadherin等蛋白形成非常紧密的连接，需要特定的酶来有效打断。
对机械力敏感：过度吹打或剧烈的物理剪切力极易损伤细胞，导致活率下降和自发分化。
对酶敏感：长时间或高浓度的酶暴露会损害细胞膜和表面蛋白，同样影响活力和多能性。
简单说：iPSC更像“精致的瓷器”，需要比普通细胞（如成纤维细胞）更温和、更精准的消化方式。

2. 常用的iPSC消化方法都有哪些？各有什么优缺点？
主流方法有以下几种

酶法（最常用）
试剂:
Accutase, Gentle Cell Dissociation Reagent，或低浓度胰酶配合EDTA。
原理： 酶解细胞间连接蛋白和细胞-基质粘连。
优点： 相对温和，可较好控制，可获得单个细胞或小细胞团（取决于消化时间）。
缺点： 需要精准掌握时间；残留酶可能影响后续实验（需充分洗涤）；成本相对高。

机械法
操作： 直接用细胞刮刀或移液器枪头刮下/吹打克隆。
优点： 快速，无酶残留。
缺点：最不推荐！ 极易造成细胞机械损伤，导致活率骤降、分化率升高，且很难获得均一的细胞团块，重复性差。

酶+机械法（结合）
操作：先用酶（如EDTA）预处理几分钟，轻微松动克隆边缘，再用移液器极其轻柔地吹打几次使克隆脱落。
优点：比纯机械法温和，比纯酶法快一点，成本较低（EDTA便宜）。
缺点：对“轻柔”操作要求极高，吹打力度和时间控制不好容易损伤细胞。

3. 用酶消解法进行消化时，时间如何把握？怎么判断“刚刚好”？
时间至关重要！没有绝对标准，需要根据细胞状态、密度、克隆大小和具体试剂调整。 一般流程和判断要点：
1. 预处理： 吸掉旧培养基，用不含Ca²⁺/Mg²⁺的缓冲液（如DPBS）轻柔洗涤1-2次，去除血清（血清会抑制酶活）。
2. 加酶： 加入适量酶（覆盖细胞层即可，约0.5-1ml/6孔板孔）。
3. 孵育： 放入37°C培养箱。关键观察期来了！

• 镜下观察（核心！）： 每隔1-2分钟取出在显微镜下观察。
• “刚刚好”的标志： 克隆边缘开始卷曲、收缩、变圆，大部分克隆从培养皿底部微微抬起，克隆间的界限变得清晰，轻轻摇晃培养皿能看到克隆明显移动甚至漂浮起来。 此时细胞团块应保持相对完整，避免看到大量单个细胞游离出来（这通常意味着消化过头了！）。

4. 终止消化： 一旦观察到上述“临界点”，立即吸掉酶液（或加入含血清的完全培养基中和酶活）。对于Accutase，可能需要加入含血清培养基后非常轻柔地吹打几次帮助脱落。
黄金法则： 宁轻勿重！ 如果时间到了边缘还没明显收缩，宁可多等1分钟观察，也不要贸然暴力吹打。消化不足比过度消化更容易补救（延长一点时间或稍加吹打）。

4. 消化后，吹打细胞有什么讲究？
极其轻柔！这是保证高活率的关键一步！
• 选择合适的枪头： 
使用大口径（如1000μl）的枪头，剪掉尖端一小部分（扩大开口）可以减少剪切力。
• 控制吹打力度和次数： 
将培养基或缓冲液沿孔壁缓慢加入，避免直接冲击细胞团块！ 吹打时动作要缓慢、平稳，次数要少（通常3-5次足够）。目标是让大的克隆团分散成适合传代的小团块（比如几十到几百个细胞一团），不追求打成单细胞悬液（除非做单细胞克隆）。

• 观察悬液状态： 
吹打后悬液应是小细胞团为主，肉眼或镜下不应看到太多单个细胞或微小碎片。

• 及时停止： 
一旦达到合适大小的团块，立即停止吹打。

5. 为什么消化后传代一定要加Rock抑制剂？
Rock抑制剂是iPSC传代后的“救命稻草”！
• 作用机理：
它抑制Rho激酶信号通路。该通路在细胞经历分离、贴壁等应激时被激活，会导致细胞凋亡（Anoikis）。
• 关键作用：
显著提高传代后细胞的存活率，促进小细胞团块的重新贴壁和铺展，减少传代后的细胞死亡和分化。
• 用法：仅在传代后的新鲜培养基中添加（通常工作浓度10μM），培养24小时后更换为不含Rock抑制剂的正常培养基。注意：不要在维持培养的常规培养基中长期添加。

6. 消化后总是有很多细胞碎片/死细胞，怎么办？
碎片多通常提示消化或吹打过程存在损伤。排查点：
• 消化过度：这是最常见原因！回顾Q3，严格控制消化时间，镜下观察是关键。
• 吹打过猛：回顾Q4，务必轻柔吹打。
• 细胞状态本身不佳：传代前细胞是否健康？密度是否合适（过密或过稀都可能导致状态差）？是否有污染？
• 洗涤不充分：残留的血清会抑制酶活，导致消化不均，部分区域消化不足而部分过度。确保用DPBS充分洗涤。
• 酶的选择或质量问题：确保使用新鲜、未反复冻融的酶，并确认酶是适用于iPSC的。
• 传代密度过低：细胞团块太少，分泌的生存因子不足，也会增加死亡。

7. 消化后细胞贴壁慢/不贴壁，可能是什么原因？
可能原因有：
• 基质问题：新板子基质（Matrigel等）包被不均匀、失效或用量不足？包被后放置时间过长？确保基质新鲜、正确包被、充分覆盖培养表面。
• 细胞团块过大或过小：消化后团块太大不易贴壁；吹打太碎成单细胞或极小团块，存活率低且贴壁困难。目标是合适的小团块（几十到几百细胞）。
• 未加或Rock抑制剂失效：确认传代培养基中正确添加了新鲜配制的Rock抑制剂。
• 细胞状态差：消化前细胞状态就不好（如分化率高、代谢废物积累多）。
• 消化损伤严重：过度消化或过度吹打导致细胞严重受损。
• 培养基问题：新换的培养基批次是否有问题？pH、渗透压是否正常？是否预热？
• 传代密度过低：细胞太少，分泌的促进贴壁因子不足。

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