芯片点样仪联合SPRi助力RNA小分子药物的高通量分子互作筛选
2025-04-22 来源:本站 点击次数:136芯片点样仪联合SPRi实现RNA小分子药物的高通量分子互作筛选
传统药物研发多聚焦于可成药的一小部分蛋白质家族，而人类基因组序列转录出的RNA分子中，超过98%为不编码蛋白质的非编码RNA（ncRNA）。这些 ncRNA 在细胞进程中意义重大，其失调或变异与多种疾病相关，如癌症和神经退行性疾病等。因此，ncRNA 成为极具潜力的药物靶点。核糖核酸酶P（RNase P）是一种广泛存在且必不可少的酶，通过剪切5'端前导序列以催化前体tRNA 的成熟。在核糖核蛋白（RNP）形式的RNase P 中，RNA 亚基（RPR）具有催化活性，其结构在不同生命域中既有保守的催化核心，又有多样化的外周元件，这种结构多样性、必要性和低拷贝数的特点，使 RNase P 成为理想的药物靶点。过去已有诸多研究尝试开发其抑制剂，如氨基糖苷类及其衍生物、亚甲蓝等酚噻嗪类衍生物，以及通过高通量筛选（HTS）发现的 iriginol hexa-acetate 和 purpurin 等。但这些抑制剂普遍存在问题，如氨基糖苷类和酚噻嗪类是混杂结合剂，对目标 RNA 选择性低；iriginol hexa-acetate 和 purpurin 虽能抑制细菌 RNase P，但后续研究发现其抑制作用是导致细菌 RPP聚集，并非直接作用于 RPR。因此，寻找新型、有效的RNase P抑制剂迫在眉睫。
文章题目为“Use of a small molecule microarray screen to identify inhibitors of the catalytic RNA subunit of Methanobrevibacter smithii RNase P”于2024年11月发表在Nucleic Acids Research杂志，作者来自于美国国家癌症研究所。
研究对象为原核生物甲烷细菌（Msm），其广泛存在于肠道中且与多种疾病有关。作者首先将Msm RPR 克隆到pBT7质粒表达载体中，并生成 5'-3'延伸变体，通过 T7 RNA 聚合酶进行体外转录反应合成RNA，将其存储在- 20°C 备用。
随后使用英国ArrayJet生物芯片点样仪将购买的7300种化合物点印到玻片上，形成高密度化合物微阵列，使用PBST缓冲液清洗后，孵育Cy5标记的Msm RPR以及对照buffer，结果通过法国Innopsys的荧光扫描仪 InnoScan 1100 AL 进行扫描分析（激发波长635 nm），发现只有在高浓度的Mg2+作用下，RPR才具有活性，并从中筛选出48种特异性结合的小分子化合物，其大多数是二芳基哌替啶类及其类似物（如图1）。
研究对象为原核生物甲烷细菌（Msm），其广泛存在于肠道中且与多种疾病有关。作者首先将Msm RPR 克隆到pBT7质粒表达载体中，并生成 5'-3'延伸变体，通过 T7 RNA 聚合酶进行体外转录反应合成RNA，将其存储在- 20°C 备用。
随后使用英国ArrayJet生物芯片点样仪将购买的7300种化合物点印到玻片上，形成高密度化合物微阵列，使用PBST缓冲液清洗后，孵育Cy5标记的Msm RPR以及对照buffer，结果通过法国Innopsys的荧光扫描仪 InnoScan 1100 AL 进行扫描分析（激发波长635 nm），发现只有在高浓度的Mg2+作用下，RPR才具有活性，并从中筛选出48种特异性结合的小分子化合物，其大多数是二芳基哌替啶类及其类似物（如图1）。
图1：图A玻片分别孵育对照buffer、cy5-oligo、Msm样品（不同浓度Mg2+处理）结果图；图B结果统计图
在发现的48种化合物中有22种可以直接商品化购买，随后对其进行Msm RPR活性分析，结果显示只有化合物 M1和M10有抑制效果，分别抑制30%和12%。同时，通过结构设计和优化对M1进行高纯度合成，对商品M1comm和合成品M1syn进行抑制常数的分析比对，两次实验取均值得KI值分别为49±13和17±1 μM，合成品的纯度高其抑制效果更好（如图2）。
图2:图A 22种小分子化合物的抑制效果统计图；图B商品M1 两次重复实验抑制常数统计结果；图C、D合成M1不同浓度的抑制效果以及两次重复实验的抑制常数统计结果
随后对合成的M1与 Msm RPR进行表面等离子共振成像（SPRi）的结合亲和力检测，即在Plexera普芯生物具有光交联表面化学修饰的SPRi芯片上制备微阵列，将M1及其类似物（10mM溶解于DMSO溶液）以8×8 阵列打印到芯片表面，每个化合物重复打印3次。打印后，芯片在真空黑暗环境下干燥8小时，再用 365nm紫外线照射15分钟，然后依次用DMSO、甲醇和去离子水洗涤，并组装到流动池中，将不同浓度的Msm RPR（0.156-20 μM）作为流动相注入流动池，进行动力学检测，设定结合时间为300秒，解离时间为300秒，流速2μL/s。利用Plexera SPR数据分析软件和GraphPad Prism 10进行亲和力分析，发现小分子化合物M1，能够抑制Msm RPR的活性，测得结合常数为8 ± 3 μM。
本研究发现二芳基哌啶化合物M1对 Msm RPR具有良好的抑制作用，且对其结构类似的Pfu RPR无抑制效果，展现出良好的选择性。这不仅为深入研究Msm RPR的功能和作用机制提供了有力工具，也为开发针对Msm RPR的特异性抑制剂奠定了基础。此外，通过对合成M1类似物进行结构-活性关系（SAR）分析，明确了M1中关键功能基团对抑制活性的影响，为后续优化抑制剂结构、提高抑制活性提供了理论依据。利用小分子微阵列（SMM）筛选技术和非标记动力学检测（SPRi）技术，成功鉴定出与Msm RPR结合的小分子，证明了该技术在筛选与识别小分子的有效性，为RNA靶向药物研发提供了新的技术手段和思路。通过 SMM 筛选，可以更高效地从大量化合物中筛选出潜在的RNA结合分子，有助于发现更多针对结构化RNA的小分子抑制剂，进一步推动RNA靶向药物的发展。
Arrayjet位于英国爱丁堡，专注于提供生物芯片应用领域的解决方案及服务。自2000年公司成立即致力于开发新型生物样品喷点方案–喷墨式液体处理平台，该系统于2006年上市，目前用户遍布全球27个国家。
Mercury系列产品采用独特的飞行喷墨点样技术实现行业第一的快速、非接触式微量液体处理。同时上万种不同样品可以进行快速点样，专利的上样模块配合高通量的点样喷头保障您的点样操作快速、无污染，更低的上样体积可有效减少样品损失，使您的珍贵样品物尽其用。该系列产品制备高密度的蛋白微阵列芯片、抗体微阵列芯片、糖微阵列芯片、小分子化合物微阵列芯片等，用于自身免疫抗体、生物标记物、候选疫苗或靶点的高通量筛选，疾病研究和新药研发等诸多科研和临床领域。
普芯生物，源于美国Lumera（2003年成立）生物检测部，2009年Plexera 成立，致力于研发无标记高通量SPRi系统和芯片药物筛选技术，2018年推出第一代PlexArray HT 并不断迭代，2023底年正式推出由苏州普芯在国内自主研发、国内硬件生产和组装同时重新设计软件系统的PlexArray HT Ultra系列。
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