本文要点：含吡啉结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体的靶向NOD样受体家族小干扰RNA（siRNA）已成为减少缺血性脑卒中后梗死体积和减轻脑损伤的重要治疗策略。然而，基于siRNA的疗法在临床转化中面临血脑屏障（BBB）的重大阻碍，限制了药物向中枢神经系统的渗透。为突破这一瓶颈，本文开发了创新型长循环近红外二区（NIR-II）纳米颗粒平台YWFC NPs，通过精密设计增强BBB转胞吞作用，实现siNLRP3的高效递送（siNLRP3@YWFC NPs），并在缺血性脑卒中临床前模型中验证其有效性。进一步地，研究者整合先进深度学习神经网络算法优化脑梗死半暗带的体内NIR-II成像，在卒中后72小时获得显著提升的信背比（SBR）。基于大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型的在体研究表明，通过延长NIR-II成像引导的siNLRP3@YWFC NPs图像导向治疗可产生显著疗效优势。

图1. 深度学习增强NIR-II成像和图像引导siRNA (siNLRP3@YWFCNPs）治疗缺血性卒中示意图

本研究开发了靶向NLRP3炎症小体的siNLRP3@YWFC纳米颗粒，其搭载全氟化碳及血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）主动靶向侧链的超长循环近红外二区平台（YW-F13/YW-CC=9:1 重量比），可穿透血脑屏障并精准递送治疗至大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型的脑梗死区域。该纳米颗粒在体外和体内实验中均显示出抑制中枢炎症、减轻脑组织损伤及改善神经功能的作用。研究首次通过深度学习增强的NIR-II平台，在治疗过程中同步实现脑梗死周围半暗带定位与梗死周边炎症浸润程度的精准成像、轮廓勾画及定量分析。

图2. YW、YW-F13和YW-CC的合成、光学和物理性能

本文开发了一种新的长循环近红外二区（NIR-II）纳米平台，由全氟碳YW-F13和VCAM-1主动靶向侧链的混合物组成（F13 = HO(CH2)2(CF2)5CF3；CC = CVHSPNKKC(Acm)）。这种组合旨在促进BBB的穿越（图2a）。图2b显示，YW的HOMO-LUMO带隙约为1.75 eV，与NIR-II噻吩并噻唑染料的阈值（通常约为1.6 eV）非常接近。纳米平台高度扭曲的主链，间隔基和电子供体之间的扭转角分别为31.04°和34.53°（图2c），使得π共轭主链可以通过侧链延伸。这种结构特性是减少分子间相互作用的关键，可能增强纳米载体在生物系统中的稳定性和功效。免疫荧光和蛋白质印迹实验进一步证明（图2d-2e），用促炎细胞因子TNF-α处理细胞6小时后，VCAM-1表达量增加了1.5倍以上（图2f）。

图3. 体外摄取和溶酶体逃逸能力siCtrl@YW-F13/YW-CC NPs

优化YW-F13和YW-CC在包载材料中的重量比对于提高纳米平台靶向和递送至BALB/c小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）的效率至关重要。研究结果表明，以YW-F13与YW-CC的9:1比例包载Cy5-siCtrl的Cy5-siCtrl@YWFC纳米粒子在bEnd.3细胞中展现出最高的细胞摄取效率，如共聚焦荧光显微镜和细胞流式摄取实验所示（图3a-c）。合成并确认了能有效与siRNA形成复合物的类脂质材料G0-C14，其重量比为10。如图3d所示，Cy5-siCtrl@YWFC纳米粒子（红色）的内化主要与晚期内体（绿色）共定位，孵育4小时后表明初始的内吞作用和向晚期内体的运输。然而，12小时后，大多数纳米粒子不再与内体共定位，表明成功逃逸内体并释放到细胞质中。

YWFC纳米粒子和siCtrl@YWFC纳米粒子均形成均匀分散的球形胶束，透射电子显微镜（TEM）测定的平均直径分别约为150纳米（图3e）和180纳米（图3f）。YWFC纳米粒子和siCtrl@YWFC纳米粒子的zeta电位（图3g）分别为约-2.17毫伏和约-0.98毫伏。YWFC纳米粒子和siCtrl@YWFC纳米粒子的光致发光激发映射（图3h-i）显示最大吸收峰分别在约738纳米和740纳米处，最大发射峰分别在约1038纳米和1048纳米处。与ICG相比，YWFC纳米粒子和siCtrl@YWFC纳米粒子均展现出更好的光稳定性，在持续激发60分钟的磷酸盐缓冲液（PBS）中几乎无衰减（图3j）。重要的是，在含10%血清的PBS中孵育7天后未观察到显著降解，表明这些纳米粒子具有相当大的稳定性。

图4. 缺血性卒中活体NIR-II成像的深度学习

在小鼠短暂大脑中动脉闭塞（tMCAO）后4小时，分别给予YWFC纳米粒子和YWF纳米粒子（5毫克/毫升，200微升）。通过NIR-II荧光成像从注射后10分钟至72小时动态可视化缺血性中风（IS）梗死区域（图4a）。利用基于深度学习的无监督转换将NIR-II图像转换为高分辨率图像（图4b）。通过基于知识蒸馏的无监督学习方案，使用不成对的高分辨率（HR）和低分辨率（LR）图像训练循环生成对抗网络，并用于处理NIR-II图像（图4c）。在生成器之间进行不同域之间的转换后，判别器DL和DH用于区分生成的图像和真实图像。用于图像翻译和分割的学生网络采用U-Net结构，在有限的训练数据下提供高性能。对于低分辨率图像输入，SGLH/SGHL和TGLH/TGHL模型均生成图像，教师模型和学生模型之间的差异用于指导学生的学习过程。如图4d所示，NIR-II图像首先转换为四通道图像，然后输入蒸馏模型进行分割。SSeg和TSeg模型同时分割同一图像，差异指导学生的学习。

基于深度学习的方法通过将次优的低分辨率图像转换为清晰的高分辨率图像来增强NIR-II成像，如NIR-IIb成像所示。此外，深度学习方法能够生成定量指标，用于通过血管分割对血管密度进行比较分析。如图4e所示，在MCAO小鼠中，静脉注射YWF纳米粒子和YWFC纳米粒子后10分钟，梗死区域的荧光信号明显低于对侧非梗死区域，从而能够在分钟级别识别缺血性中风（图4f）。深度学习模型被用于分析梗死和对侧非梗死脑区域的血管结构，能够有效区分炎症浸润，具有高度统计学显著性（P < 0.0001，图4f）。相比之下，未注射NIR-II纳米材料的PBS组在成像仪下未显示任何图像。此外，在MCAO小鼠中，静脉注射YWFC纳米粒子后，病变部位（半暗带区域）的NIR-II荧光信号从6小时到72小时逐渐增加，并在72小时达到峰值。在72小时，重建的NIR-IIb荧光成像的信背比（SBR）为6.00，比原始NIR-II荧光成像的SBR 3.30增加了1.85倍，或改善了85.1%。相比之下，由于缺乏靶向肽，YWF纳米粒子在病变部位的富集较少（图4g）。有趣的是，在梗死半暗带区域，NIR-II荧光富集的显著差异持续了长达3天，这可能是由于YWFC纳米粒子在病变部位的长时间循环（图4h）。

图5. siNLRP3@YWFC NPs压制NLRP3并抑制了体外下游相关炎症蛋白的表达

siNLRP3–1770在RT-qPCR和Western blotting实验中显示出最高的干扰NLRP3表达的效率，作为为后续研究的对象。在75 nM浓度下，经过72小时后，siNLRP3@YWFC纳米粒子对NLRP3的敲低效率在RNA和蛋白质水平上均超过60%，而未处理的细胞作为对照组（图5a-5c）。

此外，开发了一种氧糖剥夺/再氧合（OGD/R）模型来模拟体外的缺血再灌注。该模型用于评估siNLRP3@YWFC纳米粒子对脑缺血再灌注损伤（CIRI）的神经保护作用（图5d-5f）。将OGD/R处理的BV2细胞作为4小时的阳性对照，并收集细胞蛋白进行Western blot分析。靶向处理组siCtrl@YWFC纳米粒子作为对照，而非靶向处理组siNLRP3@YWF纳米粒子和靶向处理组siNLRP3@YWFC纳米粒子作为处理组。如图5g-5h所示，OGD/R阳性对照显著上调了NLRP3炎性体的表达。非靶向siNLRP3@YWF纳米粒子和靶向siNLRP3@YWFC纳米粒子分别有效敲低了NLRP3表达71.7±7.6%和83±3.2%，并抑制了下游蛋白IL-18（45.2±4.2%, 50.7±6.1%）、IL-1β（43.4±10.7%, 54.4±9%）、裂解的caspase-1（32±8.8%, 40.8±8.7%）和ASC（42.3±15.7%, 54.2±9.4%）的表达。靶向处理组对NLRP3炎性蛋白的抑制最为显著，强烈表明siNLRP3@YWFC纳米粒子通过敲低NLRP3炎性体减轻了炎症反应。

图6. NIR-II图像引导治疗siNLRP3@YWFCMCAO模型小鼠的NPs

为了进一步评估siNLRP3@YWFC纳米粒子在体内的治疗效果，将MCAO模型小鼠随机分为5组（每组5只小鼠）。小鼠在14天内每3天通过静脉注射接受一次PBS、siCtrl@YWFC纳米粒子、siNLRP3@YWF纳米粒子或siNLRP3@YWFC纳米粒子，siRNA剂量为6毫克/千克（图6a）。在3-14天的治疗周期内，siNLRP3@YWFC纳米粒子和siCtrl@YWFC纳米粒子组的梗死病变中的NIR-II荧光信号高于其他组的梗死和对侧非梗死区域（红色圈出）。然而，在治疗期间，siNLRP3@YWF纳米粒子组的双侧脑区荧光信号未见显著差异（图6b）。差异比率定义为梗死区与非梗死区NIR-II平均荧光强度差与总强度的比值，这是通过深度学习得出的定量指标。较高的差异比率表明炎症程度较高。如图6c所示，在药物注射后的前1-3天内，siNLRP3@YWFC纳米粒子和siCtrl@YWFC纳米粒子的差异比率均保持在约0.25-0.31，表明两组在脑梗死区的炎症水平无显著差异。有趣的是，在随后的4-14天内，siCtrl@YWFC纳米粒子组的差异比率显著快于siNLRP3@YWFC纳米粒子组，到第14天达到0.37±0.05。这表明梗死区的炎症程度较高，而siNLRP3@YWFC纳米粒子组的差异比率为0.19±0.08。这一量化结果证实，14天的siNLRP3@YWFC纳米粒子治疗有效抑制了炎症。各组大脑的明场和NIR-II荧光图像如图6d所示。在大脑表面荧光富集区域，siNLRP3@YWFC纳米粒子的信号低于siCtrl@YWFC纳米粒子，而siNLRP3@YWF纳米粒子在14天时梗死侧几乎无荧光信号。siNLRP3@YWF纳米粒子对NLRP3的长期抑制可能有助于观察到的炎症减少。通过7.0T小动物MRI评估了MCAO后3天和14天MCAO小鼠大脑的区域变化（图6e）。经过14天的治疗，siNLRP3@YWFC纳米粒子的混合T2信号显著低于PBS、siCtrl@YWFC纳米粒子和siNLRP3@YWF纳米粒子组，在梗死侧观察到的脑萎缩最小（图6f）。这些结果表明，siNLRP3@YWFC纳米粒子可以有效减少MCAO小鼠的脑梗死面积并限制脑萎缩。

图7. siNLRP3@YWFC减少小胶质细胞的募集，降低炎症相关因子的表达，改善中风后神经元损伤，减少脑萎缩体积

如图7a所示，siNLRP3@YWFC纳米粒子组在缺血皮质半暗带中显示出最低的NLRP3荧光表达，同时炎症标志物（如小胶质细胞标志物IBA1）减少，NeuN+神经元数量增加。与PBS、siCtrl@YWFC纳米粒子和siNLRP3@YWF纳米粒子组相比，siNLRP3@YWFC纳米粒子组显示出IBA1+细胞数量减少（图7b）、NeuN+神经元数量增加（图7c）、NLRP3荧光表达降低以及NLRP3的长期沉默，从而抑制了中枢炎症并部分恢复了神经元表达。通过苏木精-伊红（H&E）和甲基紫染色（图7d）比较了假手术组与PBS、siCtrl@YWFC纳米粒子、siNLRP3@YWF纳米粒子和siNLRP3@YWFC纳米粒子组。siNLRP3@YWFC纳米粒子治疗显著减少了梗死体积，而其他组在第14天未观察到脑梗死的显著变化（图7e）。表明siNLRP3@YWFC纳米粒子治疗有效减轻了脑萎缩。

治疗后第14天，处死模型小鼠并提取脑组织蛋白进行分析。图7f的结果表明，siNLRP3@YWFC纳米粒子组显著下调了NLRP3蛋白水平，降低了59.6±9.8%。此外，与siCtrl@YWFC纳米粒子组相比，siNLRP3@YWFC纳米粒子组炎症相关因子的蛋白表达水平降低：IL-18降低19.8±2.3%，IL-1β降低63.7±10.0%，裂解的caspase-1降低49.7±13.7%，ASC降低50.3±15.5%（图7g）。总体而言，数据表明siNLRP3@YWFC纳米粒子可以长期沉默NLRP3炎性体，抑制炎症反应，并在一定程度上保护脑神经元，从而减少脑萎缩，凸显了靶向疾病治疗的重要性。

参考文献

Yu K, Fu L, Chao Y, et al. Deep Learning Enhanced Near Infrared-II Imaging and Image-Guided Small Interfering Ribonucleic Acid Therapy of Ischemic Stroke[J]. ACS nano, 2025，19, 10, 10323–10336.

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