本文要点：通过检测染料标记的白蛋白，可在体内渗入脑实质来可视化血脑屏障（BBB）破坏。尽管伊文思蓝（EB）和吲哚菁绿（ICG）染料已被用于评估BBB损伤，但它们的可见光或近红外一区（NIR-I）成像窗口，限制了这种 “白蛋白基础”策略的成像灵敏度和对比度。在此，本文构建了一种针对白蛋白的近红外二区（NIR-II）特异性标记探针，作为发色团用于在中风中构建荧光蛋白以评估BBB破坏。经过优化的发色团C7-1080可以通过亲核取代与白蛋白共价结合，无需佐剂即可形成荧光蛋白。同时白蛋白通过紧密的夹持效应，有效增强发色团的亮度并增强其稳定性。通过理论模拟、蛋白质组学和蛋白质突变技术研究白蛋白与发色团之间的结合行为。原位NIR-II荧光蛋白构建策略联合IR-808Ac探针，有助于在缺血性中风期间对BBB破坏和脑血管实现高精度双通道成像。总体而言，这种原位白蛋白特异性标记为诊断和监测中风提供了新工具，有望用于研究相关疾病的进展和治疗反应。

在本文中，研究者应用分子侧基工程策略进一步优化染料结构，使其具有卓越且选择性的白蛋白标记特性。体外结果证实，作为发色团的NIR-II白蛋白靶向染料（C7-1080）能够在室温或生理温度下，无需任何催化剂，与人血清白蛋白（HSA）疏水腔中的半胱氨酸发生亲核取代反应，完成位点特异性共价结合，从而形成NIR-II FPs。值得注意的是，作为外壳的HSA通过紧密夹持效应增强了发色团的亮度和光稳定性。更重要的是，由染料与可靠的白蛋白相互作用原位生成的NIR-II FPs为中风中血脑屏障（BBB）破坏的精确定位提供了可能（方案1）。这项工作从仿生的角度为原位NIR-II FPs的构建提供了概念验证，有望为中风相关疾病的研究提供一种强大的技术工具。

图1. 筛选和表征具有最佳NIR-II亮度的Cn-1080染料

根据研究者之前对染料结构与外源性白蛋白结合能力的研究，选择了1080染料骨架结构作为构建原位NIR-II FPs的发色团候选（图1a）。随后，利用分子侧基工程策略对Cn-1080染料的结构进行了优化，以筛选出具有优异光学性能和高效白蛋白标记性能的最优NIR-II发色团。如图1b-d所示，NIR-II亮度、紫外吸收和荧光数据一致表明，羧基侧链的长度直接影响了Cn-1080染料的光学性能。C7-1080染料分子展现了更优的NIR-II亮度和光稳定性，远超临床批准的ICG探针（图1e）。

研究者利用分子动力学方法模拟了不同Cn-1080染料的最佳构象，并对其分子振动进行了定量分析。如图1f所示，不同Cn-1080染料的侧链呈现出不同的最佳构象，两个羧基倾向于“手拉手”形成分子内氢键以限制分子振荡。特别是，侧链长度最为合适的C7-1080染料分子能够最小化端基摆动，减少扭转分子内电荷转移（TICT）的发生，从而展现出更为出色的发光能力（图1g-i）。同时，研究者还利用密度泛函理论计算了不同Cn-1080染料的最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）（图1j）。高斯计算结果显示，侧链长度几乎不影响Cn-1080染料的带隙，因此相应的峰值没有明显的蓝移或红移。上述结果有效证实了Cn-1080染料的发光调节机制源于羧基侧链对分子骨架扭转的有效限制。综上所述，C7-1080染料有望成为构建荧光蛋白的最优NIR-II发色团候选。

本文进一步详细研究了Cn-1080染料在体内的白蛋白标记行为。如图2所示，血管造影和体内代谢成像表明，与其它Cn-1080系列染料相比，尾静脉注射后，C7-1080染料展现出更显著的荧光信号和信噪比。同时代谢数据也证实，Cn-1080系列染料具有优异的体内排泄能力，在尾静脉注射72小时后几乎无荧光信号残留。

为了深入了解体内成像差异的原因，研究者进一步分析了Cn-1080与全血（WB）以及小鼠血清（MS）的结合行为（图2b）。WB@Cn-1080和MS@Cn-1080复合物的NIR-II亮度和凝胶电泳数据均表明，C7-1080在体内展现出最佳的白蛋白荧光标记能力。此外，如图2g所示，对注射C7-1080染料的小鼠全血进行离心分析发现，C7-1080染料优先与血清中的白蛋白共价结合，而非血浆，从而在原位形成NIR-II荧光蛋白（图2h,i）。总体而言，这些研究表明C7-1080可作为白蛋白的荧光标记物，用于原位构建荧光蛋白。

图3. 使用原位白蛋白标记染料对血脑屏障（BBB）破坏进行靶向成像

血脑屏障（BBB）的特点是血液与脑实质之间具有高度选择性通透性。正常情况下，白蛋白在脑组织中很少见。然而，在中风或创伤事件后，血液可通过受损的BBB渗入脑实质，导致局部白蛋白水平急剧上升。因此，开发能与内源性白蛋白特异性原位结合的NIR-II探针，有望为监测BBB破坏提供更优越的成像工具。

得益于C7-1080染料与白蛋白之间可靠的相互作用，本文不仅能够直接观察白蛋白的泄漏，还有望在中风期间精确定位BBB的破坏部位。如图3a所示，研究者成功建立了光栓塞中风（PTS）模型，位于小鼠左侧大脑皮层的梗死区域。如图3b-d所示，先从尾静脉注射C7-1080染料，验证NIR-II FPs在体内的形成及药代动力学特征。血液亮度、凝胶电泳和蛋白染色有效证实了荧光蛋白在体内的形成，并具有持续的体内循环时间，为靶向成像BBB破坏奠定了基础。如图3e,f所示，与假手术组相比，荧光信号在中风区域逐渐累积，早在10分钟就检测到泄漏，表明其通过受损的BBB渗入脑实质。相比之下，由于白蛋白逃逸的NIR探针（IR-808Ac）与白蛋白无共价结合，其在体内的快速肝清除和短循环时间导致其无法对中风中的BBB破坏进行成像。此外，研究者通过调节光栓塞时间建立不同程度的中风模型，以评估C7-1080染料监测BBB破坏的灵敏度。令人鼓舞的是，即使在光栓塞时间为1分钟的轻度症状中风模型中，C7-1080染料仍展现出良好的BBB破坏检测效果。如图3g,h所示，TTC和EB染色区域与NIR-II荧光成像区域基本一致。这些结果表明，基于PTS方法的脑缺血中风会导致BBB损伤/破坏，使血浆成分渗入脑实质。上述现象有效表明，C7-1080染料突出的原位白蛋白标记能力是其实现对BBB破坏敏感和特异性成像的直接原因。

为了更深入地了解BBB损伤区域周围血液路径的变化，选择了另一种白蛋白逃逸的NIR探针（IR-808Ac），其在808 nm处具有最佳激发性，用于中风小鼠的脑血管可视化。研究者随后分别在两个不同的成像通道下捕获了BBB泄漏（1064 nm激发，C7-1080）和脑血管系统动态变化（808 nm激发，IR-808Ac）的NIR-II图像。结果显示，IR-808Ac不仅能够清晰、动态地描绘出缺血性中风期间血流路径的变化和恢复，还能实时区分动静脉血管。值得注意的是，双通道成像显示，在BBB损伤区域几乎未见血管被照亮。中风后的实时血管造影显示，损伤部位附近的血供暂时丧失，随后恢复，缺血区域随着时间的推移逐渐形成损伤区域。同时，双通道成像也有效地表明，缺血性中风成像的本质是通过标记白蛋白流经BBB破坏区域，从血管渗入脑实质。

基于分子侧链工程策略，本文提出了一类具有亮近红外二区（NIR-II）发光和白蛋白特异性共价标记能力的染料分子（Cn-1080），作为原位构建荧光蛋白的NIR-II发色团。体外和体内实验表明，C7-1080发色团无需额外辅助即可与白蛋白（如人血清白蛋白HSA）通过亲核取代反应实现位点特异性共价结合，原位形成NIR-II荧光蛋白。特别是作为荧光蛋白外壳的HSA，通过紧密夹持效应，增强了发色团的亮度并调节了其稳定性。发色团与白蛋白的相互作用产生的原位NIR-II荧光蛋白，不仅可以直观地显示白蛋白的泄漏，还能高精度地对缺血性中风中的血脑屏障（BBB）破坏进行成像。通过与白蛋白逃逸探针IR-800Ac的有效结合，还实现了BBB破坏和脑血管的实时双通道成像，为理解缺血性中风的机制提供了新的视角。总体而言，这种原位荧光蛋白构建策略有望弥补当前NIR-II荧光蛋白的局限性，并为中风相关疾病的研究带来新的机遇。

参考文献

Xu J, Du Y, Zhu N, et al. NIR-II Fluorescent Protein Created by In Situ Albumin-Tagging for Sensitive and Specific Imaging of Blood-Brain Barrier Disruption[J]. Advanced sScience, 2025.

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