可温和条件下高分辨率检测m6A修饰的新m6A测序方法开发研究
2025-04-28 来源:本站 点击次数:30
RNA和DNA中的化学修饰在多种生物过程中发挥着关键作用，包括转录调控、RNA降解、蛋白质翻译和免疫调节等。这些修饰已被新的测序方法以单碱基分辨率定量地绘制出来，其中核苷酸脱氨基是一种高效策略，用于选择性地绘制DNA中的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine）和RNA中的N6-甲基腺苷（m6A）。然而，传统的化学脱氨基方法依赖于在苛刻的酸性条件下使用芳基重氮盐，这限制了其在大多数生物底物中的应用。近年来，基于亚硝酸盐离子的RNA测序方法（如NO-seq和NT-seq）虽然简单且成本效益高，但低转化效率和苛刻的酸处理可能会导致RNA降解，从而影响检测的准确性。此外，GLORI方法虽然提高了脱氨基效率和选择性，但仍受到RNA降解和逆转录停止的限制，需要大量的RNA输入。
为了开发一种温和的化学脱氨基反应，以克服传统方法的局限性。近日，芝加哥大学何川团队通过设计一种接近中性pH值的温和化学脱氨基反应，不仅可以显著保护RNA，还能提高信噪比，从而实现对m6A位点的灵敏且稳健绘制。这种方法有望为研究m6A修饰在基因表达调控中的作用提供有力的工具，推动RNA修饰领域的研究进展。相关成果以《Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine in RNA》为题，发表于Nature子刊《Nature Chemistry》。
标题：Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine in RNA
发表时间：2025-4-17
发表期刊：Nature Chemistry
影响因子：IF19.2/Q1
单位：芝加哥大学
研究方法
研究者采用一种N-亚硝化策略，通过羰基有机催化剂和路易斯酸催化剂的协同催化作用，实现对RNA中腺苷（A）的脱氨基反应，将其转化为次黄嘌呤（I）。这种方法被称为化学协同催化辅助m6A测序（chemical cooperative catalysis-assisted m6A sequencing，CAM-seq）。具体实验步骤如下：
图1：羰基有机催化剂和路易斯酸催化的一级胺协同脱氨基反应。
a. 在苛刻的酸性条件下，亚硝酸盐离子通过逐步的亚硝化和重氮化反应介导脱氨基作用。
b. 本研究和GLORI-seq：由羰基有机催化剂和路易斯酸（LA）催化的协同脱氨基反应。
c. 全转录组m6A测序的m6A-CAM-seq方法示意图。RNA样本被片段化，并在优化的条件下进行处理，随后进行纯化和测序文库制备。
研究结果
（1）温和条件下对底物进行一般脱氨基处理
研究者在温和条件下对多种核苷酸底物进行了脱氨基反应，发现甘油醛与硼酸三氟化物乙醚（BF3·OEt2）组合能高效脱氨基广泛的核苷酸底物。通过改变羰基催化剂，从二羰基有机催化剂改为单羰基有机催化剂（如糠醛），可以显著提高鸟苷类似物的脱氨基产率。研究者推测这可能是因为鸟苷类似物在位置6处可以与甘油醛环化，形成鸟苷-甘油醛加合物。
d. 在优化的催化条件下，对甲基化核苷进行反应。
（2）阐明反应机制
通过15N核磁共振（NMR）光谱学跟踪反应过程，研究者发现，在没有路易斯酸的情况下，15N6腺苷与甘油醛的缩合反应非常缓慢，即使在50℃下加热2小时后，缩合产物的形成仍然很少。然而，加入BF3·OEt2后，15N标记的腺苷在半小时内迅速转化为中间体Int 3。二维1H-15N HMBC光谱学被用来监测路易斯酸催化的缩合反应，具有更高的15N灵敏度。在Na15NO2存在的情况下，15N亚胺信号消失，表明其转化为脂肪族硝基取代的中间体，并随后重排为N-亚硝化加合物。这些结果证实了通过亚胺中间体的反应路径。
b. 提出的脱氨基反应的催化循环。
（3）DNA和RNA中腺苷脱氨基的选择性条件
研究者进一步探索了优化CAM-seq选择性条件，使其对腺苷的脱氨基反应具有更高的选择性。通过测试不同的路易斯酸，发现硼酸在提高反应活性方面最为有效。在硼酸存在的情况下，二羰基化合物比单羰基化合物具有更高的脱氨基效率。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，甘油醛和三氟丙醛都表现出对腺苷的选择性，但由于三氟丙醛导致的显著DNA/RNA降解，研究者选择了甘油醛进行进一步研究。在优化的脱氨基条件下，甘油醛在DNA和RNA中都表现出对腺苷的完全脱氨基反应，而m6A位点保持不变。
c.不同羰基有机催化剂对A和C脱氨基的催化效率比较。二羰基催化剂在A位点的转化率高于C位点。
d.在优化条件下，6碱基DNA寡核苷酸CTCAGC表现出对G保护和A脱氨基的高反应性。
e.使用5碱基m6A RNA寡核苷酸探针（ACm6AGU），在与d相似条件下展示A和m6A的选择性。
f-h. LC–MS/MS监测DNA寡核苷酸脱氨基反应中甘油醛（f）、硼酸（g）和亚硝酸盐（h）浓度的优化（n=3）。
i-k. LC–MS/MS监测RNA寡核苷酸脱氨基反应中甘油醛（i）、硼酸（j）和亚硝酸盐（k）浓度的优化（n=3）。
（4）CAM-seq m6A检测的优化条件
研究者注意到，尽管甘油醛作为一种有机催化剂非常有效，但它倾向于与鸟苷形成加合物，这可能导致逆转录酶在逆转录过程中停止（RT stops）。因此，研究者选择了kethoxal作为保护基团，因为它具有更高的反应速率和更好的可逆性。在优化条件下，CAM-seq能够在接近中性的pH值下进行，显著减少RNA降解。通过测试11种不同的逆转录酶和3种不同的dNTP比例（dTTP/dCTP比例为1:1、1:40和1:400），研究者发现RevertAid RT在dTTP/dCTP比例为1:40时，背景噪声水平最低，约为0.36%。
b. 使用kethoxal保护的RNA寡核苷酸探针在与a相似的条件下展示了RT停止比率。
c-f. 在中性条件下，使用甘油醛（c,d）和kethoxal（e,f）对DNA寡核苷酸的笼化（caging）（c,e）和去笼化（decaging）（d,f）动态比较。
g. 在中性条件下，甘油醛对kethoxal完全笼化的DNA寡核苷酸的竞争。
h-i. 使用完整的RNA（h）和200个核苷酸片段化的RNA（i）进行RNA降解实验。
j. 通过插入寡核苷酸测序数据优化逆转录酶条件。测试了11种逆转录酶和3种dTTP/dCTP比例（1:1、1:40和1:400）。一个突出的条件（RevertAid RT在1:40比例下）显示出低于0.36%的背景噪声水平。
（5）人、拟南芥、玉米等不同物种转录组中的m6A全面图谱
使用优化的CAM-seq协议，研究者在人类HEK293T细胞系中鉴定了282281个高度可信的m6A位点（P＜0.001）。其中，235173个和180056个位点的修饰比例分别大于5%和10%。GAC motif最为富集，占HEK293T转录组中可信位点的54%，其次是AAC motif，占27%。值得注意的是，YAC（CAC/UAC）和RAU（GAU/AAU）motif，这些与RAC motif仅相差一个核苷酸的motif，也显示出一定程度的m6A修饰。在人类转录组中，m6A富集的motif（如GAC）在3'-UTR区域的终止密码子附近表现出明显的富集信号，进一步证实了CAM-seq能够提供整个转录组的高质量m6A图谱。
研究者还对拟南芥和玉米的RNA样本进行了分析，发现RAC motif在这些植物中也是最富集的m6A修饰motif。然而，与人类样本不同的是，RAC motif仅占植物中所有m6A位点的40%，而在人类样本中约为85%。此外，植物中AAC motif丰度最高，而在人类中则是GAC motif丰度最高。这些结果表明，植物中的m6A修饰模式与人类存在差异，可能与植物中m6A修饰的调控机制有关。
b. 多种方法检测到的m6A位点与估计背景噪声的比较。
c. CAM-seq和GLORI-seq在126362个重叠位点上m6A水平的相关性（r=0.883）。红色虚线表示相等水平。红色三角形标记的区域突出了GLORI-seq高估m6A水平的位点。
d. 在三种基于脱氨基的方法中观察到的所有m6A位点中，AAC motif的比例，计算为所有位点的（m6A比率×覆盖率）之和与所有位点的（m6A比率×覆盖率）之和的比值。
e. 人类样本中所有A位点（无过滤）的平均甲基化水平与相对motif频率的关系。GAC和AAC motif（红色）高于背景水平。整体m6A水平表示为0.41%。
f-g. 拟南芥（f）和玉米（g）中所有A位点的平均甲基化水平与相对motif频率的关系。整体m6A水平分别表示为0.77%和0.69%。
h. 人类、拟南芥和玉米中通过过滤的16 three-letter motif的频率与平均甲基化水平之间的关系。
i-k. 人（i）、拟南芥（j）和玉米（k）中相对于m6A位点的每个位置核苷酸重要性评分。
（6）饱和分析将转录速率与m6A水平关联分析
研究者通过饱和m6A图谱分析发现，基因表达水平与平均m6A水平呈负相关。具体来说，高转录率基因倾向于具有较低m6A水平，可能是由于m6A沉积复合物的可用性有限，或者甲基转移酶复合物与转录机制在细胞内的动态关联。此外，研究者还发现，基因的最大m6A修饰水平可以作为区分基因的一个重要参数。将基因分为两组：一组是所有m6A位点的修饰水平普遍较低的基因，另一组是具有高修饰潜力的基因。这两组基因的表达水平与m6A水平都呈现出显著的负相关性。
b. 基于meta基因分析，终止密码子附近的-20到+180核苷酸区域被确定为m6A沉积的热点区域。
c. 基因间和单个基因内的变异对应数据。
d. log10基因表达水平与平均m6A水平之间的关系，以等高线图表示，并带有虚线趋势线。
e. 所有基因的最大m6A修饰水平分布。低甲基化和高甲基化组的拟合曲线分别用蓝色和红色虚线标记。
f. 基因内平均m6A修饰水平与最大m6A修饰水平之间的相关性。
g-h. 仅低修饰基因（g）和仅高修饰基因（h）的log10基因表达水平与平均m6A水平之间的关系。
i. 所有基因（黑色）、无m6A修饰基因（蓝色）、低m6A修饰基因（黄色）和高m6A修饰基因（红色）的m6A水平与基因表达之间的总体关系。
CAM-seq、NO-seq、NT-seq、GLORI、MeRIP-seq等m6A测序方法介绍及比较
（1）CAM-seq（化学协同催化辅助的m6A测序）
原理：通过化学协同催化策略，利用羰基催化剂和路易斯酸催化剂的协同作用，将RNA中的腺苷（A）转化为次黄嘌呤（I），而m6A位点抵抗脱氨基反应，保持为腺苷。通过逆转录酶或DNA聚合酶读取时，I被读作鸟嘌呤（G），从而实现m6A检测。
优点：
温和条件：反应在接近中性的pH值下进行，避免了RNA降解。
低背景噪声：背景噪声低至0.5%，远低于其他方法。
低输入量：仅需10ng的RNA输入即可实现高分辨率检测。
高灵敏度：能够检测到低比例的m6A修饰位点。
应用场景：
适用于低输入量的RNA样本，如单细胞RNA测序、微量组织样本等。
（2）NO-seq（硝酸盐介导的m6A测序）
原理：通过硝酸盐离子介导的化学脱氨基反应，将RNA中的腺苷（A）转化为次黄嘌呤（I），从而实现m6A的检测。
优点：
操作简单：不需要复杂的酶反应步骤。
成本低：试剂成本较低。
缺点：
反应条件苛刻：需要在酸性条件下进行，可能导致RNA降解。
背景噪声高：由于反应不完全，背景噪声较高，影响检测准确性。
（3）NT-seq（硝酸盐介导的转录组测序）
原理：与NO-seq类似，通过硝酸盐离子介导的化学脱氨基反应，将RNA中的腺苷（A）转化为次黄嘌呤（I），从而实现m6A的检测。
优点：
操作简单：不需要复杂的酶反应步骤。
成本低：试剂成本较低。
缺点：
反应条件苛刻：需要在酸性条件下进行，可能导致RNA降解。
背景噪声高：由于反应不完全，背景噪声较高，影响检测准确性。
（4）GLORI（化学保护基团介导的m6A测序）
原理：通过化学保护基团（如甘油醛）保护鸟苷（G），然后进行化学脱氨基反应，将RNA中的腺苷（A）转化为次黄嘌呤（I），从而实现m6A的检测。
优点：
选择性高：通过保护基团的选择性保护，提高了脱氨基反应的选择性。
高灵敏度：能够检测到低比例的m6A修饰位点。
缺点：
反应条件苛刻：需要在酸性条件下进行，可能导致RNA降解。
背景噪声高：由于保护基团的不完全去除，可能导致背景噪声较高。
高输入量：需要较多的RNA输入量（通常为微克级别）。
（5）MeRIP-seq（m6A免疫沉淀测序）
原理：通过特异性的m6A抗体对RNA进行免疫沉淀，然后通过高通量测序检测m6A修饰位点。
优点：
全转录组：能够实现全转录组的m6A检测。
广泛适用：适用于多种类型的RNA样本。
缺点：
高输入量：需要较多的RNA输入量（通常为微克级别）。
背景噪声高：由于抗体的非特异性结合，可能导致背景噪声较高。
操作复杂：需要进行免疫沉淀步骤，操作较为复杂。
参考文献：
Wang, P., Ye, C., Zhao, M. et al. Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine in RNA. Nat. Chem. (2025). https://doi.org/10.1038/s41557-025-01801-3
为了开发一种温和的化学脱氨基反应，以克服传统方法的局限性。近日，芝加哥大学何川团队通过设计一种接近中性pH值的温和化学脱氨基反应，不仅可以显著保护RNA，还能提高信噪比，从而实现对m6A位点的灵敏且稳健绘制。这种方法有望为研究m6A修饰在基因表达调控中的作用提供有力的工具，推动RNA修饰领域的研究进展。相关成果以《Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine in RNA》为题，发表于Nature子刊《Nature Chemistry》。
发表时间：2025-4-17
发表期刊：Nature Chemistry
影响因子：IF19.2/Q1
单位：芝加哥大学
研究方法
研究者采用一种N-亚硝化策略，通过羰基有机催化剂和路易斯酸催化剂的协同催化作用，实现对RNA中腺苷（A）的脱氨基反应，将其转化为次黄嘌呤（I）。这种方法被称为化学协同催化辅助m6A测序（chemical cooperative catalysis-assisted m6A sequencing，CAM-seq）。具体实验步骤如下：
- 反应条件优化：通过筛选不同的路易斯酸和羰基化合物，研究者发现硼酸和甘油醛（glyoxal）在促进脱氨基反应中表现出最高的效率和选择性。反应在接近中性的pH值（pH 6.0）下进行，温度为37℃，时间为12小时。
- 保护基团的选择：为了避免甘油醛与鸟苷（G）形成加合物导致的逆转录酶停止（RT stops），研究者选择了kethoxal作为保护基团，因为它具有更高的反应速率和更好的可逆性。
- RNA样本处理：从细胞或植物组织中提取总RNA，并进行poly(A)富集。将提取的RNA片段化，以提高测序效率。
- 测序文库制备：对化学处理后的RNA进行3'-端修复，连接3'-端接头，进行逆转录反应生成cDNA，再连接cDNA接头，完成文库制备。最后对文库进行PCR扩增，并使用Illumina平台进行测序。
图1：羰基有机催化剂和路易斯酸催化的一级胺协同脱氨基反应。
b. 本研究和GLORI-seq：由羰基有机催化剂和路易斯酸（LA）催化的协同脱氨基反应。
c. 全转录组m6A测序的m6A-CAM-seq方法示意图。RNA样本被片段化，并在优化的条件下进行处理，随后进行纯化和测序文库制备。
研究结果
（1）温和条件下对底物进行一般脱氨基处理
研究者在温和条件下对多种核苷酸底物进行了脱氨基反应，发现甘油醛与硼酸三氟化物乙醚（BF3·OEt2）组合能高效脱氨基广泛的核苷酸底物。通过改变羰基催化剂，从二羰基有机催化剂改为单羰基有机催化剂（如糠醛），可以显著提高鸟苷类似物的脱氨基产率。研究者推测这可能是因为鸟苷类似物在位置6处可以与甘油醛环化，形成鸟苷-甘油醛加合物。
图2：由有机催化剂与路易斯酸共同催化的核苷酸脱氨基反应。
a-c. 以胞嘧啶（a）、腺苷（b）和鸟苷（c）及其类似物为底物的脱氨基反应范围。d. 在优化的催化条件下，对甲基化核苷进行反应。
（2）阐明反应机制
通过15N核磁共振（NMR）光谱学跟踪反应过程，研究者发现，在没有路易斯酸的情况下，15N6腺苷与甘油醛的缩合反应非常缓慢，即使在50℃下加热2小时后，缩合产物的形成仍然很少。然而，加入BF3·OEt2后，15N标记的腺苷在半小时内迅速转化为中间体Int 3。二维1H-15N HMBC光谱学被用来监测路易斯酸催化的缩合反应，具有更高的15N灵敏度。在Na15NO2存在的情况下，15N亚胺信号消失，表明其转化为脂肪族硝基取代的中间体，并随后重排为N-亚硝化加合物。这些结果证实了通过亚胺中间体的反应路径。
图3：反应机制研究与催化循环。
a. 15N6腺苷脱氨基反应的一维15N核磁共振（NMR）谱图。b. 提出的脱氨基反应的催化循环。
（3）DNA和RNA中腺苷脱氨基的选择性条件
研究者进一步探索了优化CAM-seq选择性条件，使其对腺苷的脱氨基反应具有更高的选择性。通过测试不同的路易斯酸，发现硼酸在提高反应活性方面最为有效。在硼酸存在的情况下，二羰基化合物比单羰基化合物具有更高的脱氨基效率。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，甘油醛和三氟丙醛都表现出对腺苷的选择性，但由于三氟丙醛导致的显著DNA/RNA降解，研究者选择了甘油醛进行进一步研究。在优化的脱氨基条件下，甘油醛在DNA和RNA中都表现出对腺苷的完全脱氨基反应，而m6A位点保持不变。
图4：在寡核苷酸中优化脱氨基条件。
a-b.在不同路易斯酸催化剂（a）和羰基有机催化剂（b）条件下，寡核苷酸中腺苷位点的突变比率。硼酸（红色轮廓）和甘油醛（蓝色轮廓）催化剂被选中进行进一步优化（n=4）。c.不同羰基有机催化剂对A和C脱氨基的催化效率比较。二羰基催化剂在A位点的转化率高于C位点。
d.在优化条件下，6碱基DNA寡核苷酸CTCAGC表现出对G保护和A脱氨基的高反应性。
e.使用5碱基m6A RNA寡核苷酸探针（ACm6AGU），在与d相似条件下展示A和m6A的选择性。
f-h. LC–MS/MS监测DNA寡核苷酸脱氨基反应中甘油醛（f）、硼酸（g）和亚硝酸盐（h）浓度的优化（n=3）。
i-k. LC–MS/MS监测RNA寡核苷酸脱氨基反应中甘油醛（i）、硼酸（j）和亚硝酸盐（k）浓度的优化（n=3）。
（4）CAM-seq m6A检测的优化条件
研究者注意到，尽管甘油醛作为一种有机催化剂非常有效，但它倾向于与鸟苷形成加合物，这可能导致逆转录酶在逆转录过程中停止（RT stops）。因此，研究者选择了kethoxal作为保护基团，因为它具有更高的反应速率和更好的可逆性。在优化条件下，CAM-seq能够在接近中性的pH值下进行，显著减少RNA降解。通过测试11种不同的逆转录酶和3种不同的dNTP比例（dTTP/dCTP比例为1:1、1:40和1:400），研究者发现RevertAid RT在dTTP/dCTP比例为1:40时，背景噪声水平最低，约为0.36%。
图5：CAM-seq 协议的优化。
a. 使用甘油醛保护的G位点的RNA寡核苷酸探针测试了逆转录（RT）停止情况。b. 使用kethoxal保护的RNA寡核苷酸探针在与a相似的条件下展示了RT停止比率。
c-f. 在中性条件下，使用甘油醛（c,d）和kethoxal（e,f）对DNA寡核苷酸的笼化（caging）（c,e）和去笼化（decaging）（d,f）动态比较。
g. 在中性条件下，甘油醛对kethoxal完全笼化的DNA寡核苷酸的竞争。
h-i. 使用完整的RNA（h）和200个核苷酸片段化的RNA（i）进行RNA降解实验。
j. 通过插入寡核苷酸测序数据优化逆转录酶条件。测试了11种逆转录酶和3种dTTP/dCTP比例（1:1、1:40和1:400）。一个突出的条件（RevertAid RT在1:40比例下）显示出低于0.36%的背景噪声水平。
（5）人、拟南芥、玉米等不同物种转录组中的m6A全面图谱
使用优化的CAM-seq协议，研究者在人类HEK293T细胞系中鉴定了282281个高度可信的m6A位点（P＜0.001）。其中，235173个和180056个位点的修饰比例分别大于5%和10%。GAC motif最为富集，占HEK293T转录组中可信位点的54%，其次是AAC motif，占27%。值得注意的是，YAC（CAC/UAC）和RAU（GAU/AAU）motif，这些与RAC motif仅相差一个核苷酸的motif，也显示出一定程度的m6A修饰。在人类转录组中，m6A富集的motif（如GAC）在3'-UTR区域的终止密码子附近表现出明显的富集信号，进一步证实了CAM-seq能够提供整个转录组的高质量m6A图谱。
研究者还对拟南芥和玉米的RNA样本进行了分析，发现RAC motif在这些植物中也是最富集的m6A修饰motif。然而，与人类样本不同的是，RAC motif仅占植物中所有m6A位点的40%，而在人类样本中约为85%。此外，植物中AAC motif丰度最高，而在人类中则是GAC motif丰度最高。这些结果表明，植物中的m6A修饰模式与人类存在差异，可能与植物中m6A修饰的调控机制有关。
图6：m6A修饰的精确定量揭示了在motif水平上的m6A沉积。
a. 所有A位点（覆盖度＞20）的m6A修饰水平分布，以GAC和UAG motif为例。b. 多种方法检测到的m6A位点与估计背景噪声的比较。
c. CAM-seq和GLORI-seq在126362个重叠位点上m6A水平的相关性（r=0.883）。红色虚线表示相等水平。红色三角形标记的区域突出了GLORI-seq高估m6A水平的位点。
d. 在三种基于脱氨基的方法中观察到的所有m6A位点中，AAC motif的比例，计算为所有位点的（m6A比率×覆盖率）之和与所有位点的（m6A比率×覆盖率）之和的比值。
e. 人类样本中所有A位点（无过滤）的平均甲基化水平与相对motif频率的关系。GAC和AAC motif（红色）高于背景水平。整体m6A水平表示为0.41%。
f-g. 拟南芥（f）和玉米（g）中所有A位点的平均甲基化水平与相对motif频率的关系。整体m6A水平分别表示为0.77%和0.69%。
h. 人类、拟南芥和玉米中通过过滤的16 three-letter motif的频率与平均甲基化水平之间的关系。
i-k. 人（i）、拟南芥（j）和玉米（k）中相对于m6A位点的每个位置核苷酸重要性评分。
（6）饱和分析将转录速率与m6A水平关联分析
研究者通过饱和m6A图谱分析发现，基因表达水平与平均m6A水平呈负相关。具体来说，高转录率基因倾向于具有较低m6A水平，可能是由于m6A沉积复合物的可用性有限，或者甲基转移酶复合物与转录机制在细胞内的动态关联。此外，研究者还发现，基因的最大m6A修饰水平可以作为区分基因的一个重要参数。将基因分为两组：一组是所有m6A位点的修饰水平普遍较低的基因，另一组是具有高修饰潜力的基因。这两组基因的表达水平与m6A水平都呈现出显著的负相关性。
图7：影响m6A变化的因子。
a. 插图展示了A位点的区域和基因分布如何影响基因中m6A修饰水平的变异。b. 基于meta基因分析，终止密码子附近的-20到+180核苷酸区域被确定为m6A沉积的热点区域。
c. 基因间和单个基因内的变异对应数据。
d. log10基因表达水平与平均m6A水平之间的关系，以等高线图表示，并带有虚线趋势线。
e. 所有基因的最大m6A修饰水平分布。低甲基化和高甲基化组的拟合曲线分别用蓝色和红色虚线标记。
f. 基因内平均m6A修饰水平与最大m6A修饰水平之间的相关性。
g-h. 仅低修饰基因（g）和仅高修饰基因（h）的log10基因表达水平与平均m6A水平之间的关系。
i. 所有基因（黑色）、无m6A修饰基因（蓝色）、低m6A修饰基因（黄色）和高m6A修饰基因（红色）的m6A水平与基因表达之间的总体关系。
CAM-seq、NO-seq、NT-seq、GLORI、MeRIP-seq等m6A测序方法介绍及比较
（1）CAM-seq（化学协同催化辅助的m6A测序）
原理：通过化学协同催化策略，利用羰基催化剂和路易斯酸催化剂的协同作用，将RNA中的腺苷（A）转化为次黄嘌呤（I），而m6A位点抵抗脱氨基反应，保持为腺苷。通过逆转录酶或DNA聚合酶读取时，I被读作鸟嘌呤（G），从而实现m6A检测。
优点：
温和条件：反应在接近中性的pH值下进行，避免了RNA降解。
低背景噪声：背景噪声低至0.5%，远低于其他方法。
低输入量：仅需10ng的RNA输入即可实现高分辨率检测。
高灵敏度：能够检测到低比例的m6A修饰位点。
应用场景：
适用于低输入量的RNA样本，如单细胞RNA测序、微量组织样本等。
（2）NO-seq（硝酸盐介导的m6A测序）
原理：通过硝酸盐离子介导的化学脱氨基反应，将RNA中的腺苷（A）转化为次黄嘌呤（I），从而实现m6A的检测。
优点：
操作简单：不需要复杂的酶反应步骤。
成本低：试剂成本较低。
缺点：
反应条件苛刻：需要在酸性条件下进行，可能导致RNA降解。
背景噪声高：由于反应不完全，背景噪声较高，影响检测准确性。
（3）NT-seq（硝酸盐介导的转录组测序）
原理：与NO-seq类似，通过硝酸盐离子介导的化学脱氨基反应，将RNA中的腺苷（A）转化为次黄嘌呤（I），从而实现m6A的检测。
优点：
操作简单：不需要复杂的酶反应步骤。
成本低：试剂成本较低。
缺点：
反应条件苛刻：需要在酸性条件下进行，可能导致RNA降解。
背景噪声高：由于反应不完全，背景噪声较高，影响检测准确性。
（4）GLORI（化学保护基团介导的m6A测序）
原理：通过化学保护基团（如甘油醛）保护鸟苷（G），然后进行化学脱氨基反应，将RNA中的腺苷（A）转化为次黄嘌呤（I），从而实现m6A的检测。
优点：
选择性高：通过保护基团的选择性保护，提高了脱氨基反应的选择性。
高灵敏度：能够检测到低比例的m6A修饰位点。
缺点：
反应条件苛刻：需要在酸性条件下进行，可能导致RNA降解。
背景噪声高：由于保护基团的不完全去除，可能导致背景噪声较高。
高输入量：需要较多的RNA输入量（通常为微克级别）。
（5）MeRIP-seq（m6A免疫沉淀测序）
原理：通过特异性的m6A抗体对RNA进行免疫沉淀，然后通过高通量测序检测m6A修饰位点。
优点：
全转录组：能够实现全转录组的m6A检测。
广泛适用：适用于多种类型的RNA样本。
缺点：
高输入量：需要较多的RNA输入量（通常为微克级别）。
背景噪声高：由于抗体的非特异性结合，可能导致背景噪声较高。
操作复杂：需要进行免疫沉淀步骤，操作较为复杂。
参考文献：
Wang, P., Ye, C., Zhao, M. et al. Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine in RNA. Nat. Chem. (2025). https://doi.org/10.1038/s41557-025-01801-3
相关文章
更多 >