利用3D打印口腔溶解膜注射寨卡病毒疫苗的研究应用
2025-05-23 来源:本站 点击次数:324
寨卡病毒 (ZIKV) 属于黄病毒科，早期 ZIKV 免疫是预防小脑畸形和吉兰-巴利综合征(GBS) 等并发症的首要任务。 与传统的疫苗接种方法不同，口腔溶解膜（ODF）或粘膜粘附膜技术是一个新兴的、令人兴奋的概念，可用于药物领域的疫苗设计和制剂开发。 这种有吸引力且新颖的方法可以帮助因疾病或综合征而患有吞咽困难的患者。 在这项研究中，我们研究了一种微粒寨卡疫苗，通过口腔途径在薄膜或口腔溶解膜 (ODF) 的帮助下给药，其中一次初剂量和两次加强剂量相隔两周。 在体外，ODF表现出优异的理化性质，表明该薄膜是疫苗微粒的良好载体，并且与颊粘膜具有生物相容性。 体内结果显示，针对 ZIKV 特异性免疫具有强大的体液（IgG、IgG1 和 IgG2a 亚型）和 T 细胞反应（CD4+/CD8+）。 Zika MP 疫苗和佐剂 Zika MP 疫苗都会影响记忆（CD45R/CD27）和细胞内细胞因子（TNF-α 和 IL-6）的表达。 在这项研究中，借助 ODF 通过口腔途径进行ZIKV 疫苗接种，证明了开发无痛传染病疫苗的巨大前景。
1、引言
由于粘膜相关淋巴组织（MALT）位于口腔，因此颊部给药途径是一种非常有吸引力的疫苗注射方法，可刺激粘膜免疫。虽然口服、鼻腔和肺部疫苗递送方法已被广泛讨论，但鲜为人知的舌下和口腔途径受到的关注相对较少。粘膜组织由于其广阔的表面积和免疫能力，为疫苗接种和靶向提供了有吸引力的选择。颊粘膜富含抗原呈递细胞，提供了一种对患者友好、无痛的替代方案，可能会提高疫苗接种率。一旦 ODF 被放置在颊粘膜中，称为朗格汉斯细胞和 M 细胞样细胞的 APC 就可以吸收寨卡疫苗 MP（图 1）。
利用全自动 3D 打印工艺进行 ODF 制造，我们经济高效的方法消除了手工劳动，确保了可重复性。这种创新方法有望提高疫苗的可及性、降低成本并简化疫苗接种过程。
图1.颊粘膜 ODF 中装载的寨卡 MP。 一旦 zika MP 从薄膜中释放出来，MP 就会被 APC和 M 细胞样细胞吸收以处理 ZkaMP。 处理后，APC 进入血液并前往附近的淋巴结,开始与T细胞接触，从而对寨卡病毒产生强烈的免疫反应。
2、3D 打印口腔溶解膜 (ODF) 的制备
ODF 的配方涉及使用各种可生物降解的聚合物。首先，使用乙醇作为溶剂制备Kollidon 90F (16.24% w/v) 和Kollidon VA64 (1.06% w/v)。接下来，制备 PEG 2000 (0.6% w/v) 并缓慢添加到先前的混合物中。将该混合物用箔覆盖并搅拌4小时。将所得混合物与疫苗微粒一起加载到 CELLINK BIO X3D 生物打印机（的喷嘴头上。 G 代码是为打印 ODF 而创建的。 ODF 配方是在实验室准备的模具中打印的。该模具是使用适用于两种聚合物的 SYLGARD 186 有机硅弹性体套件制备的，并将所得混合物置于 96 孔板的盖子上以制作模具。将所得混合物与灭活的寨卡病毒微粒一起装入设定为室温 (RT) 和 50 kPa（压力）的 3D 打印机中。 3D打印机完成后，将96孔板放入4℃加热室中5分钟，然后放入干燥器中过夜。
3、口腔溶解膜 (ODF) 口腔免疫的体内研究设计
所有动物实验均获得美世大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 协议 (#A2303001) 的批准。 SwissWebster (SW) 小鼠，4-6 周龄，获自 Charles River Laboratories（美国马萨诸塞州威尔明顿）。如图 2 所示，小鼠被随机分配，并使用口腔溶解膜 (ODF) 通过口腔给药接受初始剂量和两次加强剂量。每两周收集一次血清，通过酶联免疫吸附测定 (ELISA) 测定总 IgG、IgA 和 IgG 亚型（IgG2a、IgG1 和 IgG3）的抗体反应。攻击后，收获免疫器官（脾、腹股沟和腋窝淋巴结）并随后进行流式细胞术（FACS）分析。
图2.体内研究中的小鼠组 (n=6)(左)。体内研究时间线(右)评估通过口腔途径施用时初始剂量、随后两剂加强剂量的寨卡 MP 疫苗 ODF 和佐剂寨卡 MP 疫苗ODF 的给药状态。第10周对瑞士韦伯斯特小鼠进行攻击。一周后，即第11周，处死小鼠，收集免疫器官。
4、结果
使用ODF给药后，对瑞士小鼠的体液反应进行了评估。在两周的时间里(第2周和第4周)，受试者接受了两次加强针的注射。酶联免疫吸附试验(ELSA)用于分析每周收集的这些样本[1,2]。lgG抗体是一种血液稳定的抗感染药物，对人体具有长期免疫作用，是最特别的。图3展示了在瑞士Webstermice中观察到的寨卡病毒特异性gG滴度。ZIKV疫苗和无佐剂ZIKV疫苗组表现出强烈的总lgG 抗体反应。与未治疗组相比，第2周至第11周期间lgG滴度显着升高。值得注意的是，即使在第10周的攻击后，带佐剂和未带佐剂的疫苗接种组的lgG滴度仍然显着升高。与未接受佐剂的小鼠相比，带佐剂的zika MP 疫苗在第 2、4、6、8和 11 周诱导了强烈的!gG 抗体反应。 疫苗。此外，还测量了其他抗体，包括IgA和 IgG 亚型(lgG1、lgG2a和IgG3)。
图3.血清ZIKV特异性IgG滴度ELISA测定[1]。动物在第0周接受第一次注射，两次加强剂分别通过口腔给药。与未治疗对照组(第2、4、6、8和11周)相比，通过ODF接种ZikaMP疫苗和Padiuvant的小鼠表现出显著更高的耐受滴度。佐剂ZIKV疫苗与ZikaMP疫苗(第2、6、8和11周)相比，产生了显著更高的耐受滴度
5、总结
自寨卡病毒在全球爆发以来，人们一直致力于对抗这种病毒的广泛研究工作。目前尚无可用的疫苗或治疗方案。在我们的概念验证研究中，我们深入研究了一种微粒寨卡疫苗，旨在保护抗原，同时提供持续释放以增强免疫反应。与传统的基于针头的方法不同，我们探索了一种在口腔溶解膜(ODF)的帮助下通过口腔免疫接种的无痛寨卡疫苗。探索无痛替代方案可能有助于提高全球的依从性和疫苗接种率。我们的研究结果表明，寨卡MP疫苗引发了持续的抗体反应并在佐剂的帮助下增强了细胞和记忆反应。 此外，与现有文献的研究结果一致，可能需要多次接种疫苗才能建立长期免疫和交叉保护。通过这项概念验证研究，我们证明了配制能够增强体液和细胞反应的鼻内寨卡微粒疫苗的可行性。
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1、引言
由于粘膜相关淋巴组织（MALT）位于口腔，因此颊部给药途径是一种非常有吸引力的疫苗注射方法，可刺激粘膜免疫。虽然口服、鼻腔和肺部疫苗递送方法已被广泛讨论，但鲜为人知的舌下和口腔途径受到的关注相对较少。粘膜组织由于其广阔的表面积和免疫能力，为疫苗接种和靶向提供了有吸引力的选择。颊粘膜富含抗原呈递细胞，提供了一种对患者友好、无痛的替代方案，可能会提高疫苗接种率。一旦 ODF 被放置在颊粘膜中，称为朗格汉斯细胞和 M 细胞样细胞的 APC 就可以吸收寨卡疫苗 MP（图 1）。
利用全自动 3D 打印工艺进行 ODF 制造，我们经济高效的方法消除了手工劳动，确保了可重复性。这种创新方法有望提高疫苗的可及性、降低成本并简化疫苗接种过程。
2、3D 打印口腔溶解膜 (ODF) 的制备
ODF 的配方涉及使用各种可生物降解的聚合物。首先，使用乙醇作为溶剂制备Kollidon 90F (16.24% w/v) 和Kollidon VA64 (1.06% w/v)。接下来，制备 PEG 2000 (0.6% w/v) 并缓慢添加到先前的混合物中。将该混合物用箔覆盖并搅拌4小时。将所得混合物与疫苗微粒一起加载到 CELLINK BIO X3D 生物打印机（的喷嘴头上。 G 代码是为打印 ODF 而创建的。 ODF 配方是在实验室准备的模具中打印的。该模具是使用适用于两种聚合物的 SYLGARD 186 有机硅弹性体套件制备的，并将所得混合物置于 96 孔板的盖子上以制作模具。将所得混合物与灭活的寨卡病毒微粒一起装入设定为室温 (RT) 和 50 kPa（压力）的 3D 打印机中。 3D打印机完成后，将96孔板放入4℃加热室中5分钟，然后放入干燥器中过夜。
3、口腔溶解膜 (ODF) 口腔免疫的体内研究设计
所有动物实验均获得美世大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 协议 (#A2303001) 的批准。 SwissWebster (SW) 小鼠，4-6 周龄，获自 Charles River Laboratories（美国马萨诸塞州威尔明顿）。如图 2 所示，小鼠被随机分配，并使用口腔溶解膜 (ODF) 通过口腔给药接受初始剂量和两次加强剂量。每两周收集一次血清，通过酶联免疫吸附测定 (ELISA) 测定总 IgG、IgA 和 IgG 亚型（IgG2a、IgG1 和 IgG3）的抗体反应。攻击后，收获免疫器官（脾、腹股沟和腋窝淋巴结）并随后进行流式细胞术（FACS）分析。
图2.体内研究中的小鼠组 (n=6)(左)。体内研究时间线(右)评估通过口腔途径施用时初始剂量、随后两剂加强剂量的寨卡 MP 疫苗 ODF 和佐剂寨卡 MP 疫苗ODF 的给药状态。第10周对瑞士韦伯斯特小鼠进行攻击。一周后，即第11周，处死小鼠，收集免疫器官。
4、结果
使用ODF给药后，对瑞士小鼠的体液反应进行了评估。在两周的时间里(第2周和第4周)，受试者接受了两次加强针的注射。酶联免疫吸附试验(ELSA)用于分析每周收集的这些样本[1,2]。lgG抗体是一种血液稳定的抗感染药物，对人体具有长期免疫作用，是最特别的。图3展示了在瑞士Webstermice中观察到的寨卡病毒特异性gG滴度。ZIKV疫苗和无佐剂ZIKV疫苗组表现出强烈的总lgG 抗体反应。与未治疗组相比，第2周至第11周期间lgG滴度显着升高。值得注意的是，即使在第10周的攻击后，带佐剂和未带佐剂的疫苗接种组的lgG滴度仍然显着升高。与未接受佐剂的小鼠相比，带佐剂的zika MP 疫苗在第 2、4、6、8和 11 周诱导了强烈的!gG 抗体反应。 疫苗。此外，还测量了其他抗体，包括IgA和 IgG 亚型(lgG1、lgG2a和IgG3)。
5、总结
自寨卡病毒在全球爆发以来，人们一直致力于对抗这种病毒的广泛研究工作。目前尚无可用的疫苗或治疗方案。在我们的概念验证研究中，我们深入研究了一种微粒寨卡疫苗，旨在保护抗原，同时提供持续释放以增强免疫反应。与传统的基于针头的方法不同，我们探索了一种在口腔溶解膜(ODF)的帮助下通过口腔免疫接种的无痛寨卡疫苗。探索无痛替代方案可能有助于提高全球的依从性和疫苗接种率。我们的研究结果表明，寨卡MP疫苗引发了持续的抗体反应并在佐剂的帮助下增强了细胞和记忆反应。 此外，与现有文献的研究结果一致，可能需要多次接种疫苗才能建立长期免疫和交叉保护。通过这项概念验证研究，我们证明了配制能够增强体液和细胞反应的鼻内寨卡微粒疫苗的可行性。
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