Synergetic role of TRPV4 inhibitor and mechanical loading on reducing inflammation

Keywords: anti-inflammatory phenotype; inhibition, mechanical loading; macrophage polarization; mitogen-activated protein kinase (MAPK); pro-inflammatory (M1) macrophages; three-dimensional (3D) collagen matrix; transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4).

巨噬细胞是一种高度动态的细胞，参与宿主防御、组织维稳和炎症消退。解决炎症和促进组织再生的疗法通常以巨噬细胞为靶点，通过各种刺激阻断促炎（M1）激活通路，并调节其向抗炎（M2）表型分化。

巨噬细胞具有高度的机械敏感性，它们可以感知并响应微环境中的机械刺激。机械刺激，包括拉伸、压缩和间质流动，会影响巨噬细胞极化，从而驱动促炎和抗炎表型之间的转换。巨噬细胞中的机械转导涉及机械传感器（如粘附分子、细胞骨架成分和离子通道，包括瞬时受体电位香草醛4（TRPV4）通道）的复杂相互作用。

TRPV4 是一种机械敏感离子通道，可由机械刺激、温度、化学试剂以及内源性或外源性配体激活。TRPV4 激活会诱导构象变化，从而导致 Ca²+ 内流，这在调节巨噬细胞行为和炎症中至关重要。TRPV4 的药理学抑制已被证明可以减轻促炎反应。然而，尚未研究 TRPV4 抑制和机械负荷对 3D 环境中巨噬细胞极化的并发影响。

为此，美国托莱多大学生物工程系、生物科学系团队在最近的一项研究中旨在探索不同机械应变和 TRPV4 抑制剂对 3D 胶原蛋白基质中包埋的促炎巨噬细胞的协同作用。通过在基因和蛋白质水平上评估巨噬细胞表型变化和相关的机械转导途径，揭示了 TRPV4 抑制和机械负荷如何调节巨噬细胞的行为，为炎症消退和组织再生提供潜在的治疗见解。研究成果发表于 Frontiers in Immunology 期刊题为“Synergetic role of TRPV4 inhibitor and mechanical loading on reducing inflammation”。首先，为了研究 TRPV4 抑制和/或机械应变（0、3% 和 6%，0.1 Hz）下 TRPV4 表达的变化，用抗-TRPV4 抗体标记 TRPV4 离子通道。抗-TRPV4 抗体染色图像及其定量表明，在不存在抑制剂的情况下，TRPV4 表达随着机械应变幅度增加（0%-6%）逐渐增加。然而，在 TRPV4 抑制剂存在的情况下，3% 和 6% 机械应变处理后TRPV4 表达降低，且在 6% 机械负荷组中降低更多。

进一步观察胶原蛋白内部的结构变化、密度和内部的降解。Masson 三色染色显示机械应变和TRPV4抑制剂处理后胶原密度的变化（图1 A），B-CHP 染色可视化和量化胶原蛋白的降解（图1 B、C）。

图1 A 显示，与对照组（TRPV4（0）-0%）相比，暴露于不含 TRPV4 抑制剂的 3% 机械应变的 M1 巨噬细胞（TRPV4（0）-3% ）组表现出松散的胶原纤维结构。在 TRPV4（0）-3% 组中观察到的低胶原蛋白含量被 TRPV4 抑制剂部分补偿。总体而言，与 TRPV4（0）组相比，TRPV4 抑制剂（TRPV4（-）组）处理的 M1 巨噬细胞的胶原纤维更厚。这表明阻断 M1 巨噬细胞中的 TRPV4 通道可能通过阻止胶原蛋白降解和调节巨噬细胞表型来提高胶原蛋白密度。

图1 B、C显示，最高水平的降解发生在没有 TRPV4 抑制剂的 3% 机械应变组（TRPV4（0）-3%）中，与 Masson 三色染色的观察结果一致。虽然有或没有 TRPV4 抑制剂的 0% 机械应变组之间的降解胶原蛋白略有不同，但在 3% 和 6% 机械应变基质中添加 TRPV4 抑制剂导致胶原蛋白变性和降解程度降低（图1 B）。

图1 （A）用 Masson 三色染色的胶原纤维（蓝色）和细胞核（紫色）的组织学图像。（B）用 B-CH 染色的 3D 基质中降解的胶原纤维的荧光图像。（C）图像分析中降解胶原蛋白的定量。

胶原纤维密度和降解数据的变化表明，在 TRPV4 抑制和机械应变应用后，巨噬细胞存在表型变化。接下来，实验旨在验证应用于负载巨噬细胞的 3D 组织基质的 TRPV4 抑制剂和/或机械负荷是否在细胞内水平上产生免疫调节效应。使用 ELISA 评估丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的关键成分 ERK1/2 和 p38 MAPKs。正如巨噬细胞机械转导通路（图2 A）所示，响应 TRPV4 抑制和机械应变，蛋白激酶C（PKC）被激活，进一步下游传导到 MAPK、ERK1/2 和 p38 MAPKs，并触发炎症反应和促炎细胞因子和趋化因子的表达。

图2 B 显示，机械应变和 TRPV4 抑制剂在不同条件下影响 p38 MAPK 表达。在没有机械应变（0%）的情况下，p38 MAPK 表达在 TRPV4（0）和 TRPV4 抑制组（TRPV4（-））之间没有显著变化。在 3% 的机械应变下，p38 MAPK 表达显著降低至 133.53 pg/ml。在 6% 的机械应变下，TRPV4（0）组 p38 MAPK 表达显著下调至 138.53 pg/ml，（TRPV4（-））组显著下调至 149.42 pg/ml。

图2 C 显示了每组中与 ERK1/ERK2 蛋白表达相关的吸光度。在没有机械应变（0%）的情况下，ERK1/2 表达在 TRPV4（0）和 TRPV4 抑制组（TRPV4（-））之间没有显著变化。同样，在 3% 的机械应变下，即使 TRPV4 抑制，ERK1/2 的表达也没有显著变化。然而，在 6% 机械应变下，与无机械应变（0%）组相比，TRPV4（0）组的 ERK1/2 表达显著下调至 0.22AU，TRPV4（-） 组的显著下调至 0.21AU。

这些数据表明，TRPV4 抑制和机械应变联合调节巨噬细胞 MAPK 信号通路。

图2 TRPV4 抑制和机械加载后激活的机械转导途径。（B）p38 MAPK 浓度的变化。（C）ERK1/ERK2 合成。

最后，在确认关键通路受 TRPV4 抑制和机械负荷调节后，使用基因表达分析研究了 P38 和 ERK1/2 通路调节导致的巨噬细胞表型变化。评估重要促炎标志物（IL-1b、TNF-a、COX2 ）、抗炎标志物（CD163、CCL18）和基质降解标志物（MMP13）的表达（图3）。

关于炎症标志物（图3 A ），数据表明，TRPV4 抑制和机械负荷对IL-1β 表达的影响取决于应变幅度。在无机械负荷下，TRPV4（-）和 TRPV4（0）组之间的 IL-1β 水平没有显著变化。当机械应变为 3% 时，TRPV4（0）组的 IL-1β 表达比无应变组增加了近 5 倍，然而，TRPV4（-）组 IL-1β 表达显著降低。这表明 TRPV4 抑制可以抵消 3% 机械应变时 IL-1β 表达的上调。当机械应变为 6% 时，无论 TRPV4 抑制如何，所有组的 IL-1β 表达均显著降低。与 TRPV4（0）组的无机械负荷相比，3% 机械应变下 TNF-α 表达显著增加约 5 倍，然而，TRPV4（-）组在 3% 机械应变下 TNF-α 表达显著减弱。在 6% 机械应变下，虽然 TRPV4（0）组的 TNF-α 表达与 TRPV4（0）-0% 组相比没有显著变化，但在 TRPV4 抑制下，TNF-α表达与 TRPV4（0）-0% 和 TRPV4（0）-6% 组相比均显著降低。与 TRPV4（0）-0% 组相比，TRPV4（0）组 3% 和 6% 机械负荷的 COX2 表达分别增加了 2.39 倍和 4.88 倍。TRPV4（-）组 3% 和 6% 的机械负荷的 COX2 表达显著降低。MMP13 基因表达数据还表明，与 TRPV4（0）-0 组相比，TRPV4（0）组在 3% 应变时MMP13 表达显著增加。然而，在 TRPV4（-）组 3% 机械应变下，MMP13 表达显著降低。在 6% 机械应变时，与有和没有 TRPV4 抑制的 0% 和 3% 机械应变组相比，MMP13 表达在有和没有 TRPV4 抑制的情况下进一步降低。

关于抗炎标志物，在 TRPV4 抑制后，0% 机械应变组的 CD163 表达没有显著变化。在 3% 机械应变时，与 TRPV4（0）-0% 组相比，TRPV4（0）和 TRPV4（-）组的 CD163 表达显著降低。在 6% 机械应变时，与 0% 和 3% 机械应变组相比，TRPV4（0）组的 CD163 表达显著增加。在 TRPV4 抑制且 6% 机械应变后，CD163 表达与TRPV4（0）组相比降低。在 TRPV4 抑制后，0% 机械应变组的 CCL18 表达也没有显著变化。在 3% 机械应变时，与 TRPV4（0）-0% 组相比，TRPV4（0）和 TRPV4（-）组的 CCL18 表达降低。在 6% 机械应变时，与 0% 和 3% 机械应变组相比，TRPV4（0）和 TRPV4（-）组的 CCL18 表达增加。然而，在 3% 和 6% 机械负荷组内，TRPV4（0）和 TRPV4（-）组的 CCL18 表达差异无统计学意义。

热图（图3 B）直观地显示了 TRPV4 抑制剂和/或各种机械应变应用后促炎和抗炎基因表达的总体变化。热图表明，TRPV4 抑制在 3% 和 6% 的机械应变下显著降低了促炎基因的表达。具体来说，TRPV4 抑制与 6% 的机械应变协同促进抗炎巨噬细胞表型变化。

图3 （A）TRPV4 抑制剂和机械应变对 3D 胶原蛋白基质内巨噬细胞促炎和抗炎标志物以及基质降解标志物表达的影响。（B）TRPV4 抑制剂和/或各种机械加载应用后促炎和抗炎基因表达的热图。

虽然基因表达数据可能表明在 mRNA 水平上表型向 M1 或 M2 表型转变，但在没有蛋白质水平确认的情况下，仍不确定基因水平的变化是否转化为蛋白质水平并确认巨噬细胞极化。因此，免疫组化用于可视化靶向促炎巨噬细胞标志物 CD80 和抗炎巨噬细胞标志物 CD206 的表面抗体的结合。除了促炎和抗炎表面抗体外，细胞核和丝状肌动蛋白（F-actin）也分别使用 DAPI 和鬼笔环肽进行标记。将巨噬细胞暴露于有或没有 TRPV4 抑制剂的各种机械应变幅度下，图4 显示了 3D 胶原蛋白基质中巨噬细胞的细胞核、促炎和抗炎标志物以及巨噬细胞 F-肌动蛋白的共聚焦图像。

抗炎标志物 CD206 在 0% 机械应变和 3% 机械应变组中在 TRPV4 抑制后上调。与没有 TRPV4 抑制的各自对照相比，TRPV4（-）-0% 和 TRPV4（-）-3% 组中 CD206 表达增加可以明显证明这一点。相比之下，促炎标志物 CD80 在这些情况下下调，表明向抗炎表型转变。此外，当 3D 胶原蛋白基质中的巨噬细胞承受 6% 的机械应变时，TRPV4（0）和 TRPV4（-）组的 CD206 表达显著增加，突出了 6% 机械应变的抗炎作用。

图4 用 DAPI、F-肌动蛋白和鬼笔环肽、促炎（CD80）和抗炎标志物（CD206）染色的细胞核的共聚焦显微镜图像。

这项研究为 TRPV4 抑制和机械负荷对 3D 胶原蛋白基质中巨噬细胞极化和 ECM 重塑之间的复杂相互作用提供了新的见解。结果表明，机械负荷，尤其是与 TRPV4 抑制结合时，可显著调节巨噬细胞表型并影响胶原蛋白完整性，从而突出了 TRPV4 在机械转导和炎症中的关键作用。这些结果对于在炎症和基质降解是关键问题的机械动态组织和疾病中开发靶向抗炎疗法具有重要意义。

参考文献：Babaniamansour P, Jacho D, Rabino A, Garcia-Mata R, Yildirim-Ayan E. Synergetic role of TRPV4 inhibitor and mechanical loading on reducing inflammation. Front Immunol. 2025 Jan 7;15:1456042. doi: 10.3389/fimmu.2024.1456042. PMID: 39850885; PMCID: PMC11756524.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39850885/

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Electronic ISSN 1664-3224
 

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