实时荧光定量PCR反应体系中荧光信号物质使用染料法及探针法的区别
2025-06-03 来源:本站 点击次数:359
前言
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种监控核酸扩增的技术，在PCR反应体系中加入荧光物质，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。根据所加入的荧光化学物质不同可分为：染料法和探针法。
SYBR Green染料法原理
染料法利用能与DNA双链结合的染料来实现检测，如SYBR Green I。该染料在游离状态下几乎不发出荧光信号，一旦与双链DNA的双螺旋小沟结合，其荧光信号增强约1000倍。PCR扩增时，每形成一条双链，就有相应染料与双链DNA结合，产生荧光信号，检测到的荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。SYBR Green I的最大吸收波长约在497 nm，发射波长最大约在520 nm，与FAM荧光染料的光谱性质类似，因此在qPCR设备中都是第一通道检测，即“FAM/SYBR Green I”通道。
染料法的缺点是染料会与任何双链DNA序列结合。这意味着您还可以检测到非特异性qPCR产物（如引物二聚体）发出的荧光。为了消除这种风险，可以通过熔解曲线分析来检查反应特异性，或使用TaqMan方法。
在qPCR反应体系中，加入一对引物和一个特异性的TaqMan荧光探针，探针的5′端标记一个荧光基团，3′端标记一个淬灭基团。探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，引物和探针与模板特异性结合，当延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'端外切酶活性将探针水解切割，荧光基团和淬灭基团分离，荧光信号开始积累。所以，每形成一条DNA双链，就会水解一个探针，释放一份荧光基团以积累荧光信号，检测到的荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。
与染料法相比，TaqMan探针的使用更昂贵，但也提供了两个显著的优势：
1. TaqMan 检测仅测量靶序列的扩增进程，因为探针具有靶标特异性。
2. 通过向预混液中添加不同的引物和具有不同荧光基团的TaqMan探针，您可以在单个反应中监测多种qPCR产物的量。这种多重方法允许您在每个热循环结束时检测多个荧光信号。
一般qPCR设备会配有1个或多个不同的荧光通道，根据仪器荧光通道的配置，可以通过对不同靶标基因的探针标记不同的荧光基团，以实现多重PCR的检测。常用的荧光基团及淬灭基团如下：
QX系列实时荧光定量PCR系统
杰莱美QX系列实时荧光定量PCR系统，采用先进的双PID算法和温控技术，结合免维护光学系统和灵活的连接操控方式。这不仅提供了更快的升降温速度，同时还带来了更好的温控精准度和均一性，以确保您实验数据的准确性和可靠性。配合业界领先的荧光定量PCR数据处理软件，QX系列将荧光信号处理、专业的数据计算方法、严谨的统计学分析功能整合为一站式解决方案，从核酸到蛋白研究，满足探索各种科学问题的实验需要，重新定义了科研级荧光定量PCR系统。
该系统最大可实现单管6重荧光检测，6通道96孔检测时间不超过5秒，实现对珍贵样本最大限度的利用和数据挖掘。另外，可兼容各种常见的荧光基团或染料，激发/检测波长470-725nm。白色LED提供更宽泛的激发光波长，定制滤光片组激发/检测波长范围可达到360-750nm，还可升级FRET通道开展蛋白质热迁移分析或FRET探针监测。
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种监控核酸扩增的技术，在PCR反应体系中加入荧光物质，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。根据所加入的荧光化学物质不同可分为：染料法和探针法。
SYBR Green染料法原理
染料法利用能与DNA双链结合的染料来实现检测，如SYBR Green I。该染料在游离状态下几乎不发出荧光信号，一旦与双链DNA的双螺旋小沟结合，其荧光信号增强约1000倍。PCR扩增时，每形成一条双链，就有相应染料与双链DNA结合，产生荧光信号，检测到的荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。SYBR Green I的最大吸收波长约在497 nm，发射波长最大约在520 nm，与FAM荧光染料的光谱性质类似，因此在qPCR设备中都是第一通道检测，即“FAM/SYBR Green I”通道。
染料法的缺点是染料会与任何双链DNA序列结合。这意味着您还可以检测到非特异性qPCR产物（如引物二聚体）发出的荧光。为了消除这种风险，可以通过熔解曲线分析来检查反应特异性，或使用TaqMan方法。
图1：使用染料法和探针法原理示意图
TaqMan探针法原理在qPCR反应体系中，加入一对引物和一个特异性的TaqMan荧光探针，探针的5′端标记一个荧光基团，3′端标记一个淬灭基团。探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，引物和探针与模板特异性结合，当延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'端外切酶活性将探针水解切割，荧光基团和淬灭基团分离，荧光信号开始积累。所以，每形成一条DNA双链，就会水解一个探针，释放一份荧光基团以积累荧光信号，检测到的荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。
与染料法相比，TaqMan探针的使用更昂贵，但也提供了两个显著的优势：
1. TaqMan 检测仅测量靶序列的扩增进程，因为探针具有靶标特异性。
2. 通过向预混液中添加不同的引物和具有不同荧光基团的TaqMan探针，您可以在单个反应中监测多种qPCR产物的量。这种多重方法允许您在每个热循环结束时检测多个荧光信号。
一般qPCR设备会配有1个或多个不同的荧光通道，根据仪器荧光通道的配置，可以通过对不同靶标基因的探针标记不同的荧光基团，以实现多重PCR的检测。常用的荧光基团及淬灭基团如下：
图2：常用的荧光基团及淬灭基团
QX系列实时荧光定量PCR系统
杰莱美QX系列实时荧光定量PCR系统，采用先进的双PID算法和温控技术，结合免维护光学系统和灵活的连接操控方式。这不仅提供了更快的升降温速度，同时还带来了更好的温控精准度和均一性，以确保您实验数据的准确性和可靠性。配合业界领先的荧光定量PCR数据处理软件，QX系列将荧光信号处理、专业的数据计算方法、严谨的统计学分析功能整合为一站式解决方案，从核酸到蛋白研究，满足探索各种科学问题的实验需要，重新定义了科研级荧光定量PCR系统。
该系统最大可实现单管6重荧光检测，6通道96孔检测时间不超过5秒，实现对珍贵样本最大限度的利用和数据挖掘。另外，可兼容各种常见的荧光基团或染料，激发/检测波长470-725nm。白色LED提供更宽泛的激发光波长，定制滤光片组激发/检测波长范围可达到360-750nm，还可升级FRET通道开展蛋白质热迁移分析或FRET探针监测。
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