论文全称：
High-resolution structural and functional deep brain imaging using adaptive optics three-photon microscopy

作者：

Lina Streich, Juan Carlos Boffi, Ling Wang等

发表期刊：Nature Methods

发表时间：2021年9月30日

重要发现
01三光子激发：突破组织散射的“光学钥匙”
传统双光子显微镜（2PM）受限于表层离焦荧光干扰，在哺乳动物大脑中的成像深度仅约1毫米。三光子显微镜（3PM）通过长波长激发（1300nm）和非线性三光子吸收效应，显著降低背景噪声，将有效成像深度拓展至1.4毫米（小鼠海马CA1区边缘）。其核心优势包括：

高信号背景比（SBR）：在深层组织中，3PM的SBR比2PM提升数倍，例如在皮层下900微米处可分辨单个突触结构（直径约0.5微米）。

低光损伤特性：通过优化激光参数（<50fs脉冲宽度、0.5–22mW平均功率），焦点能量控制在<2nJ，低于组织损伤阈值，可实现长时间活体观测而不引发光毒性。

抗噪能力：即使在SBR极低的深层区域（如海马>1毫米处），AO仍能通过神经元胞体信号完成像差校正，信号增强达8倍，轴向分辨率提升4倍。

大视场校正：轴向校正范围覆盖数百微米，允许在离优化点较远的区域（如不同皮层层或海马深层）维持高分辨率，无需依赖侵入性梯度折射率透镜。

实验显示，AO校正后，皮层下900微米的突触棘突和海马1.4毫米处的树突精细结构均清晰可辨，空间频率分布恢复至理论衍射极限的90%以上。

03心电图门控：冻结生理运动的“时间快门”
心脏搏动引发的脑组织微位移是深层成像的另一难题。研究团队通过FPGA实时同步扫描与心电图R波，在心跳峰值期间暂停成像，将帧间运动伪影降低60%，帧间相关性从0.94提升至0.98。

非侵入性优势：无需植入传感器或复杂后期处理，仅通过外部电极采集心电信号，适用于长期植入窗口的自由活动动物。

深度适用性：在海马>1毫米深度，ECG门控使树突成像的信噪比（SNR）提升3倍，允许通过帧平均进一步增强信号，而传统非门控方法因伪影重叠无法实现。

白质纤维性星形胶质细胞：在胼胝体（深度862微米）观测到微域钙瞬变，尽管缺乏典型突触接触，仍表现出与神经元活动相关的功能性信号。

皮层深层原生质星形胶质细胞：在皮层V-VI层（深度835微米），AO校正后检测到的钙活性微域数量增加50%，揭示其对局部神经环路的动态调控潜力。

创新与亮点
01技术协同突破三大瓶颈

像差校正：传统AO在深层低信号环境中效率不足，而模态-based AO通过全局波前调制，在信噪比比1还低的条件下仍能收敛，校正速度<500毫秒/模态。

运动伪影：ECG门控相比传统事后校正更高效，扫描占空比仅降低40–60%，远优于主动运动补偿技术的复杂性。

03科学价值：从神经元到胶质细胞的解析
该技术首次在活体中清晰呈现深层神经元突触可塑性（如皮层棘突动态变化）和胶质细胞功能异质性，为研究神经退行性疾病（如阿尔茨海默病的海马突触丢失）、脱髓鞘病变等提供了关键工具。例如，通过AO校正，可在海马CA1区观测到单个树突棘的钙信号，而传统方法因像差模糊无法分辨。

总结与展望
三光子显微镜与自适应光学、心电门控的结合，标志着活体深层成像技术进入新纪元。其1.4毫米的穿透深度、亚微米级分辨率及非侵入性特性，使科学家得以窥视大脑“无人区”的神经活动细节，从神经元突触到胶质细胞微域，全方位解析脑功能的细胞基础。

未来，该技术有望通过波前整形技术与三光子的结合（如同时校正散射与像差），进一步提升成像深度至2毫米以上；微型化探头的开发则可能实现自由活动动物的全脑实时成像。从基础神经科学到临床前研究，这项“光学革命”正推动我们向“解码大脑”的终极目标迈出关键一步——或许在不久的将来，人类能借助这双“光学慧眼”，真正揭开意识、记忆与疾病的神秘面纱。

DOI:10.1038/s41592-021-01257-6.