本文概述了共聚焦显微镜中常用的重要检测器。“共聚焦显微镜”在此特指“真共聚焦扫描”，即仅对单点进行激发和测量的技术。本文旨在为用户提供不同技术之间清晰的概览，并针对不同应用场景给出合适的检测器选择建议，而非深入探讨专业细节。

测量方法和直方图
到达阳极的电荷云会产生一个电压脉冲。更准确地说，施加在高压上的正电位会被到达的负电荷以脉冲形式略微衰减。此时的电荷是可测量的，但仍然非常微弱。因此，需要进行仔细的设计以确保获得有意义的测量结果。基本上，有三种不同的测量概念，将在下文概述。这些概念适用于所有类型的检测器，包括“雪崩光电二极管”和“混合探测器”章节中描述的雪崩光电二极管和混合探测器。然而，这些方法并非对所有检测器都同样适用。

我们在此也想探讨一下评估方法，因为用户与其说是对检测器的工作原理感兴趣，不如说是更关心这些信号对其测量和研究的意义。

电荷放大器
图6：检测器S在吸收一个光量子hν后产生电荷Q。该电荷由一个运算放大器进行累加。运算放大器（OP）确保其反相输入端（–）的电压始终等于同相输入端（+）的电压。因此，当来自PMT阳极的电荷到达时，会立即通过对电容器C充电来进行补偿（红色圆圈）。然后，电容器上的电荷对应于在整个测量时间内到达的电荷，输出电压Ua与C成正比，因此可以进行测量。在一个像素的测量结束后，系统会被重置为零。
测量PMT信号的传统技术是使用所谓的电荷放大器。在扫描显微镜中，激发光束持续扫描样品，每条扫描线都需要划分为所需数量的像素。对于经典的结构图像，典型的记录时间约为一秒，每幅图像包含1000条扫描线，每条线包含1000个像素。因此，每个像素的记录时间约为1微秒。在这1微秒内，来自PMT的所有电荷都会在电容器中累积，如图7所示。总时间的一部分会用于重置电荷放大器，以便其在下一个像素的测量时重新从零开始。最终得到一个与从PMT接收的总电荷成正比的电压。然后，该电压通过模数转换器（ADC）转换为“灰度值”。通常使用8位分辨率，即灰度值是介于0和255之间的整数。通过调节PMT的高压，可以确保测得的信号“落入”这8位范围内，即充分利用整个动态范围，而不会因过载而导致信号截断。
图7：使用电荷放大器进行测量时，在一个像素的时间段内，电荷脉冲（蓝色）和积分信号（红色）的变化。亮度读数是最终的积分值。然后在重置阶段对电容器进行放电，以便开始下一个像素的测量。
显然，这些灰度值并不代表绝对亮度值，而只能用于比较不同图像区域的相对亮度，或者比较在相同测量设置下采集的图像的亮度。如上所述，每个入射光子的信号强度变化很大。在一个图像元素的亮度测量时间内，会有若干甚至许多光子入射。可能的取值是单个光子电荷的所有组合，这些组合本身就是准连续变化的。因此，累积测量中的光子事件完全模糊，信号强度呈现连续分布。数字化过程则将这种连续分布转换为256个离散的亮度值，即灰度值。
图8：植物根茎切片的双通道图像。感兴趣区域用黄线标出。大部分区域是黑色背景，在直方图的左侧区域，即低灰度值区域，表现为非常高的峰值。为了使实际信号的直方图清晰可见，计数被限制为仅显示非背景结果。红色通道的信号是红色直方图中的肩部（介于80和200灰度值之间）。
当然，实验人员通常并不关注单个图像元素的亮度，而是关注诸如完整细胞或组织成分等结构的强度。因此，他们会选择一个感兴趣区域（ROI）并获取其亮度值。根据图像分辨率（通常约为1000 x 1000像素，即1百万像素），数百甚至数千个图像元素会被组合成一个单一的数值。然后，可以将该平均值与其他结构的值进行比较，或者在活体材料实验中将其绘制为时间变化曲线等。例如，还可以更精确地分析该区域内的亮度分布。为此，需要生成一个直方图，统计具有特定亮度的图像元素数量。由于有256种不同的亮度级别，因此在8位直方图的x轴上会显示从0到255的数字。由于数字化过程，这里不存在中间值。因此，严格来说，直方图中不应存在连续的线条。此外，y轴上绘制的频率也只能是整数，这很合理，因为它们代表图像元素的数量。图8展示了一个此类直方图。我们可以从该直方图中提取各种细节；这里我们主要关注三个属性。
如果亮度分布是对称的，则平均亮度值位于直方图的最大值处。然而，我们经常会观察到某种程度的不对称性，表明平均值略微偏离最大值，可能偏左或偏右。
对于极端的亮度波动，曲线会变得非常“宽”。如果没有方差，则只会有一个灰度值，“曲线”将无限窄。因此，宽度是方差的体现。然而，影响这种方差的因素不仅是每次测量时间内到达图像元素的 photons 数量分布，还包括测量系统的噪声特性，尤其是PMT以及电子设备的噪声。只有当这些噪声部分足够小时，才有可能根据平均值与宽度的比率来估计 contributing photons 的数量。
由于零点由电子设备的设置固定，因此无法从灰度值直方图中推断出背景亮度中PMT暗电流的比例。
为了获得可用的图像，需要大约为3的信噪比（SNR）。当在图像元素中记录到10个光子时，即可达到此信噪比。对于线频为1 kHz的1百万像素图像，这意味着每秒有1000万个光子入射。然而，通常我们会尽量使用较弱的光照，因为高强度激发会破坏荧光染料，且产生的分解产物通常对生物体有害。因此，需要降低激发强度，以在图像质量和样本稳定性之间取得平衡。因此，每个像素通常只记录到平均1到3个甚至更少的光子。即使信号极其微弱，只要每个像素的平均光子数远小于1，仍然可以进行有效的评估。
为什么即使只有10个光子，我们也能获得远超过200种不同的灰度值？15种不同的亮度级别难道不够吗？如果每个光子在图像中产生相同的信号，那么15级就足够了。但是，正如我们上面所述，脉冲高度变化很大（强度存在噪声）。如果一个像素中累加了多个光子的脉冲，则可能的亮度值数量会再次增加。这就是亮度级别数量庞大的原因。而且，使用的级别越多（例如使用约12或16位的较低灰度分辨率），我们就越会放大脉冲变化产生的噪声。然而，这样做并不能提供更好的信息。
图9：上图：如果图像中只使用了少量灰度级，则直方图仅在狭窄的范围内显示数值。下图：如果将这些灰度级乘以一个系数，以充分利用8位动态范围（例如，为了使显示器上的图像更易于观察），则灰度级的数量保持不变，中间的级别仍然为空，从而导致直方图中出现“间隙”。

直方图还提供其他有用的信息。如果在记录过程中没有充分利用0到255的完整动态范围，而只使用了底部十分之一（0到25），则显示器上的图像会非常暗，因为显示器只使用了0到25的灰度值。我们只能通过“扩展”直方图来使图像变亮，这是当今所有数码相机都自动提供的常用技术。这种方法是将每个像素的亮度值乘以相同的系数Z。在上述情况下，我们需要将所有值乘以10，以覆盖0到255的范围。然而，由于最初只有25个不同的值，因此最终图像中也只有25个不同的值。因此，直方图会出现间隙；在我们的示例中，所有绘制的灰度值之间都缺少9个值。因此，图表看起来有些“杂乱”，但数据是正确的。
虽然电荷放大器多年来一直用作共聚焦显微镜上测量PMT信号的设备，但它现在已基本被其他技术取代（见下文）。电荷放大器提供的信号是对整个像素时间内的信号进行积分，因此结果取决于像素时间的长度。然而，如果改变扫描格式（例如，在相同的扫描速度下，每行只记录100个而不是1000个像素），则像素时间会发生变化。此时信号会增大10倍，因此需要调整PMT上的高压。改变扫描速度也会产生相同的效果。此外，由于电荷放大器的复位需要一定的时间，因此每个像素的测量时间都会损失一部分。在高扫描速度和高分辨率下，像素时间非常短，复位造成的损失会变得显著。直接数字化可以解决这个问题。

直接数字化
图10：与图7中相同的光子事件。与高保真技术类似，PMT输出端的信号以高频率直接数字化（红色星号）。数字化频率（采样时钟）设置得足够高，以高于测量系统的电子带宽（“过采样”），从而确保信号被完整捕获。

现代数字化电路的速度足够快，能够直接将PMT信号转换为数字量。具体方法是通过一个适当阻值的电阻对PMT产生的电荷进行放电，并以高时钟频率将由此产生的电压转换为灰度值。单个图像元素的数据在记录过程中会立即进行平均，因此，无论记录一个图像元素需要多长时间，图像最终获得的灰度值都能真实地反映样本的强度。采用这种方法，无需重新调整PMT的高压，可以直接比较亮度值。此外，也不存在因复位而造成的时间损失。
使用直接数字化方法获得的直方图与使用电荷放大器时获得的直方图看起来完全相同，并且基本上包含相同的信息。这是因为平均方法本质上也是对测量数据进行累加，只不过是立即在正确的时间轴上进行缩放。扫描变焦也不会改变图像亮度，除非是由于不同程度的荧光染料漂白等原因造成的真实亮度变化——但这属于有价值的信息，而不是测量伪影。漂白现象也可以通过这种方法立即进行量化。
这项技术的另一个优点是不存在因清空存储器而造成的死时间。这使得在极短的像素时间内能够获得更好的信噪比。

光子计数
我们现在可以使用清晰简洁的直方图来描述强度。然而，有趣的是，世界远非如此平滑和连续。正如马克斯·普朗克[7]无意中发现的那样，光并非以连续强度的形式存在。因此，我们的探测器测量的是单个事件——光子的到达，而不是连续的强度值。表面上的连续性是测量上的模糊性造成的：PMT模拟测量的直方图显示的是模糊测量的合并结果。正如我们已经提到的，PMT接收到的每个光子都会产生一个宽度变化的脉冲，其强度先上升后下降。通过对大量宽度和高度不同的脉冲进行积分或平均，可以获得一个看似连续的亮度直方图，其中可以出现任何强度值。此外，这些强度值的数量取决于数据记录中人为设定的“灰度深度”。然而，事实并非如此。仔细考虑后会发现，像素中的亮度不能用有理数表示。它只能是一个整数，事实上，它只能是在该像素的测量时间内到达探测器的光子确切数量。因此，与其对每个脉冲的电荷（即脉冲曲线下的面积）进行积分或平均，不如直接计数到达阳极的电荷脉冲，而不评估脉冲大小。这将解决大部分噪声问题。
* 事实上，光强也取决于光子的颜色，这会对脉冲高度产生轻微影响。然而，这种能量差异在整个光谱范围内仅约为2电子伏特。与第一个倍增极上约80伏特的电压相比，这可以忽略不计。对于下文将讨论的混合探测器（HyD），这种变化甚至要小一百倍左右。
光电子的初始速度也存在类似情况，正如我们之前提到的，光电子可以从阴极向任何方向发射。一些光电子会朝着期望的方向运动，而另一些则需要通过改变方向来加速，这会导致它们撞击倍增极时的动能有所损失。这种动能的变化范围也在±2电子伏特左右。
图11：与图7和图10中相同的光子事件。对单个光子产生的电荷脉冲进行计数称为“光子计数”。虽然这项技术产生的噪声远低于电荷放大，但它只能应用于高度相似且不会相互重叠的脉冲。此外，较小的脉冲可能无法被识别。

如今，这种计数器在电子学中已成为标准配置。脉冲的高度或斜率用于激活一个触发器，每次触发计数器值加1。在一个像素的测量结束时，计数器会被重置为0（这个过程几乎不耗时），然后重新开始计数。然而，这种方法的局限性在图11中显而易见：脉冲必须能够被单独分辨。如果第二个脉冲在第一个脉冲期间发生，则只会检测到一个脉冲，导致后续测量的亮度值偏低。脉冲是否能够分离取决于脉冲之间的时间间隔和脉冲宽度。较宽的脉冲只适用于较低的亮度，因为否则脉冲之间会过于接近，容易发生重叠。较窄的脉冲即使在高强度（即较短的脉冲间隔）下也能产生良好的计数结果。
典型的PMT输出的脉冲宽度约为20纳秒，可以有效区分。如果光子总是以相同的时间间隔到达，则计数率可高达每秒5000万次（50 Mcps）。然而，由于光子的到达是随机的，脉冲重叠的概率会大大增加，从而降低了最高计数率。这里所说的最高计数率是指，当超过该计数率时，实际触发的光电子数量与测量到的脉冲数量之间的关系不再呈线性。诚然，这是一个取决于误差容限的任意定义。如果允许的偏差仅为1%，则线性关系会在0.5 Mcps时结束；如果允许10%的偏差，则线性关系会在5 Mcps时结束。在日常实践中，1%的精度通常难以达到，而10%则超过了容忍阈值。例如，可以将阈值设定为6%，从而在计数率略高于10 Mcps时获得有效的测量结果。
如果我们暂时假设没有亮度波动（例如，通过照射一个固定点，不进行扫描），则光子平均会均匀地到达探测器，但其到达是随机的。在这种泊松过程中，光子之间的时间间隔可以用指数分布来描述。我们无需在此深入探讨细节，只需说明此过程可以用精确的数学术语来描述。在一定程度上，我们可以利用它来计算由脉冲重叠引起的、导致线性偏差的误差。然而，如果已知误差，我们就可以使用测得的脉冲数反推实际到达的脉冲数。这种方法在未经校正时误差变得显著的脉冲率的五倍范围内有效。因此，这种校正方法被称为线性化。这是一种用于扩展测量范围的、广为人知且有充分描述的方法[7]。

图 12：图12：通过校正统计概率实现计数率的线性化。请注意对数x轴[6]。
与原始计数的脉冲（对应于光子）不同，这种线性化方法（类似于展宽）在计算中会产生小数以及整数。这反过来会影响直方图，因为直方图通常只绘制整数，例如灰度值。无论如何，这些能量通道的宽度通常总是恒定的，并且总是可以将任何小数转换为整数，例如从0开始然后简单地继续计数。因此，线性化会导致直方图中出现拍频效应，从而使个别能量值远超出直方图的包络线。虽然起初可能令人困惑，但这是对统计校正后的光子数的精确表示。

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