猫冠状病毒S蛋白（Spike 蛋白，刺突蛋白）是病毒包膜表面的关键结构蛋白，负责识别宿主细胞受体并介导病毒入侵，其构象和功能依赖于复杂的翻译后修饰（如糖基化），因此真核表达系统是获取具有天然活性 S 蛋白的主要手段。以下从结构、真核表达系统选择、蛋白分子量及制备流程等方面详细介绍：

猫冠状病毒（FCoV）的 S 蛋白是一种 Ⅰ 型跨膜糖蛋白，整体结构分为三个功能区：

• 胞外区：包含受体结合域（RBD）和融合肽（FP），RBD 可特异性结合宿主细胞表面的氨肽酶 N（APN）受体，是病毒入侵的关键识别位点；融合肽在病毒与宿主细胞膜接触后介导膜融合。
• 跨膜区：锚定 S 蛋白于病毒包膜或感染细胞的细胞膜上。
• 胞内区：较短，可能参与病毒组装过程中的信号传递。

S 蛋白在天然状态下以同源三聚体形式存在，且需经过糖基化修饰（约含 20-30 个 N - 糖基化位点），这些修饰对维持蛋白构象、受体结合能力及免疫原性至关重要。

由于 S 蛋白需要复杂的糖基化修饰和正确的三聚体折叠，原核表达系统（如大肠杆菌）无法满足需求，因此必须采用真核表达系统。常用系统及其特点如下：

1. 昆虫细胞 - 杆状病毒系统（BEVS）

   • 优势：可高效表达大分子量蛋白，糖基化修饰接近哺乳动物细胞（虽略简单，但足以支持 S 蛋白的基本功能），且易于大规模培养。
   • 应用：常用于制备 S 蛋白三聚体，用于受体结合实验或疫苗候选抗原。

2. 哺乳动物细胞系统

   • 常用细胞：HEK293（人胚肾细胞）、CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。
   • 优势：糖基化修饰最接近天然病毒 S 蛋白，能准确折叠形成功能性三聚体，适合研究蛋白的天然构象和免疫原性。
   • 不足：表达量相对较低，成本较高，适合小批量、高活性的 S 蛋白制备。

3. 酵母系统（如毕赤酵母）

   • 优势：操作简便、成本低，可实现高密度发酵。
   • 局限性：糖基化修饰与哺乳动物差异较大（高甘露糖型），可能影响 S 蛋白的受体结合或免疫原性，应用较少。

天然 S 蛋白的分子量因糖基化修饰程度而异：

• 未糖基化的 S 蛋白前体（单体）分子量约为180-200 kDa（由约 1400-1500 个氨基酸组成）。
• 经真核系统表达并糖基化后，单体分子量增至200-250 kDa；三聚体分子量约为600-750 kDa。

1. 基因优化与载体构建

   • 从 FCoV 毒株中克隆 S 蛋白全长或功能片段（如 RBD、三聚体稳定型 S 蛋白）的基因，根据表达宿主（如 HEK293）进行密码子优化，以提高表达效率。
   • 将基因插入真核表达载体（如 pcDNA3.1），载体需含信号肽（引导蛋白分泌至细胞外）、标签（如 His-tag、Fc-tag，便于纯化）及启动子（如 CMV 启动子）。

2. 细胞转染与表达筛选

   • 采用脂质体或电穿孔法将重组载体转染至哺乳动物细胞（如 HEK293F 悬浮细胞），通过抗性筛选获得稳定表达株（或瞬时表达）。
   • 优化培养条件（温度 37℃、CO₂浓度 5%），收集细胞上清（分泌型表达）或细胞裂解液（胞内表达），通过 Western blot 检测 S 蛋白表达情况。

3. 蛋白纯化

   • 基于标签进行亲和层析：如 His-tag 蛋白用 Ni²⁺-NTA 柱，Fc-tag 蛋白用 Protein A/G 柱。
   • 进一步纯化：通过离子交换层析、凝胶过滤层析去除杂蛋白，获得高纯度 S 蛋白。
   • 三聚体纯化：若目标为功能性三聚体，可利用凝胶过滤层析分离单体与三聚体组分（三聚体分子量更大，出峰更早）。

4. 活性鉴定

   • 构象验证：通过圆二色谱（CD）或低温电镜分析蛋白折叠状态。
   • 功能验证：采用受体结合实验（如 ELISA 检测与 APN 受体的结合能力）或假病毒中和实验（评估其诱导中和抗体的潜力）。

1. 病毒入侵机制研究：通过真核表达的 S 蛋白，解析其与宿主受体（APN）的相互作用，揭示 FCoV 的感染机制。
2. 诊断试剂开发：以 S 蛋白（尤其是 RBD）为抗原，检测猫血清中的中和抗体，评估感染或免疫状态（中和抗体可反映对病毒的保护力）。
3. 疫苗研发：S 蛋白是诱导中和抗体的关键靶标，真核表达的功能性 S 蛋白（如三聚体）是亚单位疫苗的核心成分，可激发宿主产生保护性免疫应答。

猫冠状病毒 S 真核蛋白的制备依赖于能提供复杂糖基化修饰的真核表达系统（如哺乳动物细胞或昆虫细胞），其天然构象和功能对病毒入侵机制研究、诊断及疫苗开发至关重要。相较于原核表达，真核系统虽成本较高，但能保证 S 蛋白的生物学活性，是相关应用的首选方案。