新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）的 HN 蛋白（Hemagglutinin-Neuraminidase Protein，血凝素 - 神经氨酸酶蛋白）是病毒包膜上另一种关键糖蛋白，与 F 蛋白协同介导病毒入侵，并具有独立的免疫原性。以下从结构功能、真核表达特点及应用等方面，详细介绍新城疫 HN 真核蛋白：

• 整体结构：HN 蛋白以同源四聚体形式存在（由 4 个相同亚基组成），每个亚基分子量约 75-80 kDa，含胞外区（占 90% 以上）、跨膜区和胞质尾。胞外区是功能核心，包含血凝素、神经氨酸酶活性位点及抗原表位。
• 关键功能域： 
  • 受体结合位点：位于胞外区顶端，可特异性识别宿主细胞表面的唾液酸受体（如禽类呼吸道和消化道上皮细胞的糖蛋白 / 糖脂），介导病毒吸附。
  • 神经氨酸酶活性位点：催化唾液酸从糖链上水解，其功能包括：① 促进病毒从感染细胞释放（避免子代病毒聚集）；② 协助病毒穿透宿主黏液层（黏液中含大量唾液酸，可 “捕获” 病毒）；③ 调节受体结合亲和力，避免病毒过度吸附于已感染细胞。
  • 与 F 蛋白相互作用的区域：HN 蛋白通过特定位点（如某些保守氨基酸残基）与 F 蛋白结合，触发 F 蛋白构象变化，间接激活 F 蛋白的膜融合功能（无 HN 蛋白时，F 蛋白无法有效介导融合）。
  • 抗原表位：胞外区含多个线性和构象型抗原表位，其中部分表位可诱导中和抗体，或作为 T 细胞识别的抗原位点。

• 病毒吸附与释放：通过血凝素活性结合宿主细胞受体，启动感染；通过神经氨酸酶活性水解受体，帮助子代病毒脱离感染细胞，扩散至新细胞。
• 辅助膜融合：与 F 蛋白相互作用，为 F 蛋白提供 “活化信号”，使其从无活性构象转变为可介导膜融合的活性构象（F 蛋白单独存在时无法完成融合）。
• 免疫原性：虽诱导中和抗体的能力弱于 F 蛋白，但仍是重要的免疫原，其抗体可通过阻断病毒吸附（抗血凝素活性）或抑制释放（抗神经氨酸酶活性）发挥保护作用；同时，HN 蛋白可激活 T 细胞免疫，参与清除感染细胞。

HN 蛋白的功能依赖于正确的糖基化修饰、四聚体组装及构象完整性（如受体结合位点和抗原表位的空间结构），原核表达系统（如大肠杆菌）无法实现这些加工，表达产物多为无活性的单体或错误折叠形式。真核表达系统因具备完善的蛋白修饰和组装机制，成为 HN 蛋白表达的理想选择：

• 正确糖基化修饰：HN 蛋白含多个 N - 糖基化位点，糖基化不仅影响其稳定性，还参与受体结合和抗原表位形成。真核细胞（如哺乳动物细胞、昆虫细胞）可模拟病毒天然的糖基化模式（如唾液酸化、岩藻糖化），确保蛋白功能正常。
• 四聚体组装：HN 蛋白需形成四聚体才具有完整的血凝素和神经氨酸酶活性，真核细胞的内质网 - 高尔基体系统可辅助亚基正确组装，维持多聚体结构。
• 构象完整性：真核表达的 HN 蛋白可折叠为天然构象，保留受体结合位点、与 F 蛋白相互作用的区域及构象型抗原表位，确保其生物学活性和免疫原性。

• 哺乳动物细胞系统（如 HEK293、Vero）： 
  • 优势：糖基化修饰最接近天然 NDV HN 蛋白（尤其是禽类来源细胞，如 DF-1 鸡成纤维细胞），四聚体组装效率高，适合研究 HN 蛋白与宿主受体的相互作用或制备高活性抗原。
  • 局限：表达量较低（微克级 / 升），成本较高，适合小批量、高活性需求的场景（如机制研究）。
• 昆虫细胞 - 杆状病毒系统（BEVS）： 
  • 优势：表达量高（毫克级 / 升），可高效分泌可溶性 HN 蛋白（或膜结合形式），四聚体组装能力强，且糖基化修饰虽与哺乳动物细胞有差异（如高甘露糖型），但对 HN 蛋白的酶活性和抗原性影响较小。
  • 应用：是大规模制备 HN 蛋白的首选系统，适合亚单位疫苗、诊断试剂的工业化生产。
• 酵母表达系统（如毕赤酵母）： 
  • 优势：成本低、培养简单，可实现高密度发酵，表达量高（毫克级 / 升），且能对蛋白进行糖基化修饰（虽与天然模式有差异，但可通过基因工程改造优化）。
  • 局限：四聚体组装效率略低于昆虫细胞，部分构象型表位可能受影响，适合对活性要求稍低的场景（如诊断抗原）。

1. 基因优化与载体构建：

   • 克隆 NDV HN 基因（全长或胞外区片段，胞外区更易可溶性表达），根据昆虫细胞密码子偏好性优化序列（如调整密码子使用频率），提升表达效率。
   • 构建重组载体：将 HN 基因插入杆状病毒表达载体（如 pFastBac™），可在 C 端添加 His-tag、Strep-tag 等标签（便于纯化），同时保留信号肽以促进分泌表达。

2. 重组病毒制备与蛋白表达：

   • 转化含 Bacmid 的大肠杆菌，获得重组 Bacmid 后转染 Sf9 或 Sf21 昆虫细胞，培养扩增重组杆状病毒。
   • 用重组病毒感染对数期昆虫细胞（MOI=2-5），培养 72-96 小时，HN 蛋白可分泌至上清（胞外区片段）或锚定于细胞膜（全长蛋白）。

3. 蛋白纯化与活性验证：

   • 纯化：通过亲和层析（如镍柱结合 His-tag）纯化上清中的可溶性 HN 蛋白，结合凝胶过滤层析去除聚合体或单体杂质，获得四聚体纯品（纯度 > 90%）。
   • 验证： 
     • 结构验证：SDS-PAGE 检测分子量（还原条件下为单体，非还原条件下可见四聚体），Western blot 用抗 HN 单抗确认特异性。
     • 功能验证： 
       • 血凝试验：检测其与鸡红细胞的凝集能力（血凝素活性），并可被特异性抗体抑制（血凝抑制试验）。
       • 神经氨酸酶活性试验：通过荧光底物或比色法检测其水解唾液酸的能力。
       • 抗原性验证：ELISA 检测与 NDV 阳性血清的结合能力，评估构象型表位完整性。

1. 亚单位疫苗研发：

   • 作为联合抗原：与 F 蛋白协同使用（如 “F+HN” 混合疫苗），可诱导更全面的免疫应答（F 蛋白主要诱导中和抗体，HN 蛋白辅助增强抗体水平和细胞免疫），提升保护效力。
   • 新型疫苗载体：将 HN 蛋白与其他病原抗原（如禽流感 HA 蛋白）融合表达，利用其免疫原性和靶向性，开发多联疫苗。

2. 诊断试剂开发：

   • 抗体检测：作为 ELISA 或血凝抑制试验的抗原，检测禽类血清中的 NDV 抗体，用于评估疫苗免疫效果或流行病学调查。真核表达的 HN 蛋白因保留天然构象，检测特异性和灵敏度显著高于原核蛋白。
   • 病毒检测：制备抗 HN 蛋白单克隆抗体，开发免疫荧光、胶体金试纸条等试剂，快速检测样本中的 NDV 抗原。

3. 基础研究：

   • 解析 HN 蛋白与 F 蛋白的相互作用机制（如结合位点、构象变化传递），阐明病毒膜融合的分子机制，为设计阻断剂（如靶向 HN-F 相互作用的肽类药物）提供依据。
   • 研究不同毒株 HN 蛋白的变异（如受体结合位点突变）与宿主适应性、致病性的关系，为 NDV 进化分析和防控策略制定提供参考。

HN 蛋白是 NDV 感染和免疫的 “多功能蛋白”，其真核表达产物因保留天然结构和活性，在新城疫的疫苗研发、诊断及机制研究中具有不可替代的价值。昆虫细胞系统凭借高效表达和低成本优势，成为 HN 真核蛋白规模化生产的主流选择，为禽类传染病的精准防控提供了关键材料。