通常，细胞或组织中的特异性 Marker 意味着启动子的活性在这种细胞类型中相对较高，而并非在其他细胞中完全不表达。在其他细胞中，目的启动子也可能被弱激活，这种现象也被叫做异位表达。异位表达对谱系追踪的影响很大，常常会导致一些关于细胞命运的争议。

图. 异位表达对谱系示踪的影响^[1]

为了更精准的标记特定细胞类型，避免异位表达的影响，我们可以借助两个（甚至以上）的 Marker 进行标记，那么在小鼠中利用多个 Marker 标记时，我们就涉及到了使用多种重组酶与报告基因小鼠。

谱系示踪系类课程往期回顾：
【谱系示踪系列第一期】基础细胞标记方式
【谱系示踪系列第二期】单重组酶介导的多色报告系统方法
【谱系示踪系列第三期】多重组酶介导的交叉报告基因方法
谱系示踪的难点——基因标记的异位表达如何避免？（上） 
谱系示踪的难点——基因标记的异位表达如何避免？（中）

前几期，我们为大家讲述的几种避免基因异位表达的系统均是针对报告基因小鼠进行相应改造，利用报告基因小鼠上的多对重组位点与报告基因的交错排列来实现标记不同细胞类型的目的。那么，是否存在针对重组酶设计的系统呢？

roxCre遗传策略

roxCre 是将 rox-Stop-rox（RSR）插入 Cre 编码区前或编码区中，在移除 Stop 序列之前，Cre 无法正确进行转录和翻译。将该小鼠与另一个 Marker 基因启动的 Dre 小鼠进行交配后，Dre 介导 RSR 之间发生重组将 Stop 序列去除后，该 Cre 才能正常发挥功能。

图. roxCre 小鼠的两种类型

有同学会提问，当 RSR 插入 Cre 编码区时，即使通过 Dre-rox 重组去除 RSR 后，在其编码序列中会包含一个剩余的 rox 位点，这个位点是否会影响 Cre 的重组效率呢？
 

中科院周斌团队对此进行了相关研究，研究者在 Cre 的12个不同位点分别插入了 rox 序列，其中大部分位于螺旋结构域之间。由于插入额外的 rox 氨基酸会改变 Cre 的原始序列，他们将这种包含剩余 rox 位点的 Cre 称为 mCre。研究者通过通过用12个版本的 mCre（mCre1~mCre12）和响应的GFP报告基因转染细胞来筛选它们的重组效率。结果证明，mCre1、2、3、4、6、7、10和11的效率与传统Cre相当。说明通过合适的插入位点设计，包含 rox 位点的 Cre 与 普通 Cre 的重组效率可保持一致。
 

图. 12种不同插入位点的mCre小鼠的重组效率检测^[2]

那么，这种 roxCre 遗传策略如何帮助我们精确标记细胞群呢？

若我们想标记 A⁺B⁺ 细胞，我们就可以利用启动子 A 介导的 roxCre 小鼠、启动子 B 驱动的 Dre 小鼠、以及 LSL-Reporter 小鼠进行交配：
 

图. roxCre 小鼠的基因重组图解

1 A⁺B^- 细胞或A^-B⁺ 细胞：
仅 makerA 表达时，Cre 由于RSR的存在而无法正确进行转录和翻译，该类型细胞无法被标记。仅makerB 表达时，Dre 酶 无法重组 Loxp 位点，细胞无法被标记。

2 A⁺B⁺ 细胞：
makerB 介导 Dre 表达，Dre 酶会切除 roxCre 系统中两个 Rox 位点之间的 stop 序列。makerA 可介导 Cre 酶表达，Cre 酶重组报告小鼠的 Loxp 位点，去除 LSL 中的Stop序列。因此，该类型细胞被 Reporter 基因标记。

案例1

损伤后出现的过多的心肌成纤维细胞是组织纤维化的关键因素。经前期研究，心肌成纤维细胞主要来源于心外膜与心内膜。由于心内膜细胞与心外膜细胞功能上的差异，研究者怀疑来自不同来源的成纤维细胞在心脏纤维化期间可能表现出不同的功能。为探索这一问题，研究者首先需准确标记不同来源的心肌成纤维细胞。

以心内膜衍生成纤维细胞为例，研究者利用了心内膜细胞marker Col1a2 与成纤维细胞 marker Nfatc1，构建了以下小鼠：Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP。
 

图. Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP小鼠的基因重组图解^[3]

关于 Col1a2-RSR-CreER，激活 CreER 需要 Dre 和 TAM 两者共同存在。因此，在 TAM 诱导下，该小鼠可以标记 Col1a2 与 Nfatc1 双阳性细胞，即心内膜衍生成纤维细胞。

图. 使用roxCreER准确标记心内膜衍生成纤维细胞^[3]

除上述通过加入 Stop 序列来调控 Cre 酶的活性的 roxCre 遗传策略外，还有另一种思路，同样也可以达到使用一种重组酶，调控另一种重组酶重组活性的策略。那就是 CrexER 遗传策略。

CrexER 遗传策略

CrexER 策略是通过将两个 rox 位点插入到 CreER cDNA 的雌激素受体编码区的两侧，形成了可切换的 CreER 重组酶。由于 ER 的影响，在理想情况下，Cre-ER 蛋白是位于细胞质的，无法入核发挥重组酶活性，而将该小鼠与另一个 Marker 基因启动的 Dre 小鼠进行交配后，Dre 介导 RSR 之间的重组并将ER区去除，该 Cre 即可正常发挥功能。

图. CrexER小鼠的基因重组图解^[4]

与前一套遗传策略相似，CrexER 遗传策略同样适用于标记 A⁺B⁺ 细胞。

案例2
据报道，间皮细胞标志物 Wt1 在发育中的冠状动脉血管中表达，但在其他血管中不表达，并且Wt1-CreER 小鼠可标记心外膜细胞与胚胎心脏中的冠状动脉内皮细胞。而第二个标记物 Tie2 是泛内皮细胞标记物，在大多数血管以及某些髓系细胞群中表达。

研究者关注的是冠状动脉内皮细胞，因而他们构建了以下的小鼠：Tie2-Dre;Wt1-CrexER;R26-LSL-tdTomato。
 

图. Tie2-Dre;Wt1-CrexER;R26-LSL-tdTomato 小鼠的基因重组图解^[4]

利用 CrexER 系统，他们精准标记到了 Wt1 和 Tie2 的双阳性的细胞群，经过检测，被标记为红色的细胞群中致密心肌中内皮细胞占比 97.15%±0.61%。

图. 使用 CrexER 准确标记心肌中内皮细胞^[4].

CDH3 为心肌内皮细胞的另一 Marker。图中红色（CrexER 策略）与绿色（CDH3 标记）信号基本一致。

上述讲述的两种对重组酶的改造方案，可标记的细胞类型均为A⁺B⁺ 细胞群。下面介绍一种可标记A⁺B^- 细胞的重组酶改造方式。

dCreER 遗传策略

dCreER 策略是通过将两个 rox 位点插入到 CreER 整体编码区的两侧，整段 CreER 均可以被 Dre 重组酶删除。由于这样的设计，因而导致当 Dre 酶不存在时，CreER 正常表达行使功能，当 Dre 酶存在时，CreER 序列被剪切，无法进行表达或翻译。
 

图. dCreER 小鼠的基因重组图解

如上图所示，dCreER 遗传策略适用于标记 A⁺B^- 细胞。

案例3
哺乳动物的脂肪组织有两种不同类型：WAT 和 BAT。目前没有很好的标记 WAT 的 marker，主要方式还是依靠泛脂肪 marker PLIN1，而 BAT 可以使用棕色脂肪组织 marker UCP1 进行标记。

因而研究者利用 dCreER 遗传策略，构建了 Plin1-dCreER;Ucp1-Dre;R26-tdTomato 小鼠（下述将 Plin1-dCreER;Ucp1-Dre 交配小鼠称为 WA-iCre 小鼠）
 

图. WA-iCre;R26-tdTomato 小鼠的基因重组图解^[5]

在 WAT 中，PLIN1 正常表达，UCP1 不表达，因而在 TAM 的作用下，细胞被标记为红色；在 BAT 中，UCP1 表达，进而 Dre 介导两个 Rox 位点发生重组，PLIN1 之后的 CreER 酶被去除，导致细胞无法被标记上颜色。
 

图. 使用 dCreER 准确标记 WAT 细胞^[5]

以上是在谱系示踪中对重组酶的几种改造方案，经过改造后，一种重组酶的活性可受到另一种重组酶的调控，这种制约关系可帮助我们精准地标记目的细胞。

关于谱系示踪的各类工具介绍已经讲述完毕，虽然涉及的类型非常多，应用也较为繁琐，但可以帮助我们快速检索目的细胞，明确细胞命运。最后一期，我们将对前面讲述的的各类工具进行一个梳理，并为您介绍这些工具相互连用的进阶案例，大家敬请期待~

Reference：
[1] He L, Li Y, Li Y, Pu W, Huang X, Tian X, Wang Y, Zhang H, Liu Q, Zhang L, Zhao H, Tang J, Ji H, Cai D, Han Z, Han Z, Nie Y, Hu S, Wang QD, Sun R, Fei J, Wang F, Chen T, Yan Y, Huang H, Pu WT, Zhou B. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498. doi: 10.1038/nm.4437. Epub 2017 Nov 13. PMID: 29131159; PMCID: PMC6913096.
[2] Shi Mengyang, Li Jie, Liu Xiuxiu, Liu Kuo, Pu Wenjuan, Weng Wendong, Zhang Shaohua, Zhao Huan, Lui Kathy O., Zhou Bin (2024) The robust, high-throughput, and temporally regulated roxCre and loxCre reporting systems for genetic modifications in vivo eLife 13:RP97717 https://doi.org/10.7554/eLife.97717.1
[3] Han, M., Liu, Z., Liu, L. et al. Dual genetic tracing reveals a unique fibroblast subpopulation modulating cardiac fibrosis. Nat Genet 55, 665–678 (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-023-01337-7
[4] Pu W, He L, Han X, Tian X, Li Y, Zhang H, Liu Q, Huang X, Zhang L, Wang QD, Yu Z, Yang X, Smart N, Zhou B. Genetic Targeting of Organ-Specific Blood Vessels. Circ Res. 2018 Jun 22;123(1):86-99. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.118.312981. Epub 2018 May 15. PMID: 29764841; PMCID: PMC6015762.
[5] Han X, Zhang Z, He L, Zhu H, Li Y, Pu W, Han M, Zhao H, Liu K, Li Y, Huang X, Zhang M, Jin H, Lv Z, Tang J, Wang J, Sun R, Fei J, Tian X, Duan S, Wang QD, Wang L, He B, Zhou B. A suite of new Dre recombinase drivers markedly expands the ability to perform intersectional genetic targeting. Cell Stem Cell. 2021 Jun 3;28(6):1160-1176.e7. doi: 10.1016/j.stem.2021.01.007. Epub 2021 Feb 9. PMID: 33567267.

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