冷晶体停搏液联合保存液上调NR4A3借代谢重编程提升供心保护研究
2025-08-25 来源:本站 点击次数:43心脏移植是应对终末期心力衰竭最为有效的治疗手段，但心脏移植术后出现不良结果的风险也在显著增加。当前供体心脏供应与临床实际需求之间存在着明显差距，制定科学合理的供体器官保存策略尤为重要。这样的策略能够拓展供体库范围或大幅提升边缘供体心脏的实际可用程度，为更多患者带来生机。
静态冷保存（SCS）作为心脏移植中供体心脏保存的黄金标准方法，沿用至今。在心脏移植实践中，威斯康星大学（UW）保存液的使用频率位居榜首。但UW保存液存在一定局限性，在冷保存阶段，它仅能降低细胞代谢速率，但无法使其完全停止。一旦移植物的缺血时长超过6小时，进行性缺血损伤难以规避。缺血时间的持续延长是公认的原发性移植物功能障碍（PGD）的一个关键风险因素，而PGD是导致术后低心输出量综合征的首要原因。
缺血时，代谢变化对心脏组织耐受缺血应激极为关键，缺血过程会消耗碳水化合物、脂肪、蛋白质等代谢营养素。同时，长时间冷缺血心脏发生PGD的分子机制尚不明确。SCS后的缺血 - 再灌注损伤，会因ROS生成、炎症风暴及程序性细胞死亡导致PGD，低温下受损线粒体产生活性氧，引发系列不良变化，触发免疫反应。研究显示，Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 3（NR4A3）可能在心肌缺血 - 再灌注损伤中起关键作用，明确其机制和靶点，有助于创新SCS及心脏移植策略。
基于UW溶液在诱导快速心脏骤停和保存供体心脏方面的局限性，华中科技大学同济医学院协和医院董念国教授团队开创性地推出晶体停搏液（CC）联合UW保存液的全新供体心脏获取与保存方案。
研究结果：
1. 使用传统UW溶液进行供体心肌保护，使心脏代谢重编程，缺血耐受性降低
为探讨传统UW溶液对供体心脏在SCS过程中代谢的影响，并确定其是否可用于长期SCS，通过非靶向GC/LC-MS对不同时间点接受SCS的猪心脏进行非定量代谢组学分析。发现使用UW保存液时，心脏收缩停止耗时久，能量代谢物消耗大，左、右心室代谢物变化显著。D-葡萄糖持续消耗，不同时间点多种代谢物水平在左、右心室有不同变化，左心室在心脏泵血关键作用下，其不同时间点间的代谢物变化与对照组差异明显。KEGG分析显示特定代谢途径相关代谢物在0小时升高后缺失，特定氨基酸代谢物水平持续下降。
图1 使用UW溶液进行SCS时猪心脏的代谢变化
2. CC+UW法诱导供体心脏快速心脏骤停，减缓心脏代谢物的消耗
研发出CC+UW供体心脏获取与保存新方法，该方法能快速使心脏收缩停止。相比UW，CC+UW法显著减少SCS期间D-葡萄糖消耗，降低糖酵解通量，TCA循环（三羧酸循环）代谢物变化有特点，还能防止氨基酸消耗。小鼠同基因异位心脏移植实验表明，经8小时SCS后，CC+UW组心脏功能优于UW组，心肌损伤更小，细胞凋亡程度更低，血清心肌酶浓度更低。
图2 CC+UW方法可诱导供体心脏快速心脏骤停，并减缓心脏代谢物的消耗
3. CC+UW抑制核因子κB（NFκB）相关炎症通路的激活
SCS期间，异常代谢会导致线粒体损伤，触发促炎信号通路和级联反应。左、右心室表现不同。利用磷酸化抗体芯片发现，4小时组差异磷酸化蛋白富集于与细胞死亡和周期相关通路，8小时组富集于炎症相关通路，CC+UW组和UW组在三个时间点差异磷酸化蛋白均富集于NFκB通路。研究NFκB发现，随SCS时间增加促炎蛋白磷酸化增加，抗炎蛋白磷酸化降低，CC+UW可降低p65等磷酸化，增加XIAP磷酸化。小鼠SCS模型验证，抑制NFκB可减少心肌凋亡、ROS产生和线粒体损伤 。
图3 CC+UW方法改变了不同信号通路中富集位点的磷酸化，并降低了NFκB通路中p65（Ser529）的磷酸化
4. 单细胞核RNA测序（snRNA-seq）显示，在经CC+UW处理的心肌细胞中NR4A3基因表达上调
为探究调控NFκB相关炎症通路的分子，进行snRNA-seq，将细胞分八类，心肌细胞和成纤维细胞占多数。提取心肌细胞细胞核进行PCA发现两组转录有差异，CC+UW组NR4A3在各时间点上调最显著且被验证，该组NR4A3阳性细胞比例高且激活，UW组几乎无活性。二次聚类分十个心肌细胞组，部分组NR4A3上调并定义为高表达细胞。分析显示NR4A3hi_car细胞分化程度高，部分基因表达与NR4A3lo_car细胞有差异，XIAP 高表达。细胞通讯和基因关联分析表明，NR4A3hi_car细胞与免疫细胞相互作用强，NR4A3lo_car细胞促炎基因表达高，CC+UW组 NR4A3上调或重塑转录网络、抑制炎症、增强心肌功能。
图4 snRNA-seq揭示了左心室组织的细胞图谱，并确定NR4A3为一个关键基因
5. SCS过程中，NR4A3过表达通过抑制双特异性磷酸酶2（DUSP2）降低NFκB - p65（Ser529）的磷酸化水平
研究了NR4A3对小鼠心脏在SCS条件下的影响及其作用机制。通过尾静脉注射过表达NR4A3的腺相关病毒，发现过表达NR4A3可减轻SCS诱导的小鼠心脏损伤，表现为左心室射血分数提高、ROS积累减少、细胞凋亡减少以及心肌损伤生物标志物（LDH、LDH1、CK、CK-MB）血清浓度降低。Western blot表明NR4A3可抑制p65（Ser529）的磷酸化。RNA测序和CUT&Tag分析发现NR4A3过表达影响的基因在细胞凋亡等信号通路中富集，且确定了与NR4A3相关的基因，其中DUSP2可激活NFκB通路且其启动子与 NR4A3结合。进一步研究发现，NR4A3过表达可降低DUSP2蛋白水平，抑制DUSP2可降低 p65（Ser529）磷酸化水平、减少心肌细胞凋亡和ROS产生。综上，NR4A3可能通过抑制DUSP2转录，降低p65磷酸化水平，减轻SCS对小鼠心脏的损伤。
图5 SCS期间NR4A3过表达对小鼠心脏NFκB通路的影响
6. CC+UW可改善Langendorff灌注大鼠心室压、电传导和心律
在Langendorff灌流的大鼠心脏进行电标测实验，以验证CC+UW处理方法的效果。研究发现，CC+UW-8h组动脉波相似。在计算左室收缩期末峰值压和左室舒张末期峰值压后，发现CC+UW组在8h的脉压变化大于对照组。上述结果表明，CC+UW可恢复大鼠心脏射血功能。
在电传导方面，对照组和CC+UW-8h组呈现相似的等时图和离散图，与UW处理8小时组相比左心室电传导性更强、传导速度更快。其传导离散程度和窦性心律恢复时间与对照组相当，UW处理8小时组则显著增加。
心电图评估显示，CC+UW处理8小时组波形与对照组相似，心率略低，QRS和QT时间间隔短但因静态冷保存较对照组有所延长，三组心室有效不应期相当。
综上，CC+UW处理方法可增强电传导和心室射血、减少心律失常并提高心脏移植存活率。
图6 CC+UW对大鼠电生理标测指标的影响
7. CC+UW使得长时间冷缺血的供体心脏能够被使用，并提高心脏移植后的中期生存率
利用临床队列对比了武汉协和医院使用的CC+UW保存方法和UNOS数据库中UW保存液的效果。纳入360名CC+UW受者和13164名UW受者，发现CC+UW组供者冷缺血时间更长，两组总体生存率相当。多因素Cox回归分析表明，随着冷缺血时间增加风险比上升，且CC+UW组冷缺血时间超过5.8小时风险显著增加，而UW组超过3.3小时风险较高。KM生存分析显示，UW组冷缺血时间≥6小时的供者生存率优于<6小时的供者，CC+UW组两组无显著差异，且CC+UW 可扩大长时间冷缺血供者来源。因两组存在差异难以进行倾向得分匹配（PSM），利用美国器官共享联合网络（UNOS）数据库中281名CC+UW供者进行PSM匹配后发现，CC+UW组生存率显著高于UW组，多因素Cox回归分析显示，使用UW保存液也是影响中期生存的一个危险因素，并且会对供体风险指数（DRI）和IMAPCT评分产生影响。
图7 CC+UW可延长冷缺血时间供体的使用，并提高心脏移植后的中期生存率。研究纳入了美国器官共享联合网络（UNOS）2005至2021年成年心脏移植受者数据，以及武汉协和医院2019至 2023年心脏移植队列
结论：
研究证实CC联合UW法是一种高效的供体心脏获取与保存策略。该方法既能减少能量损耗又能缓解炎症反应，极具发展潜力。有望成为拓宽心脏移植适用标准、缓解供体心脏短缺困境的实用技术，为心脏移植领域带来新的突破。