DNA甲基化助力揭示花青素生物合成调控柑橘果实品质的表观新机制
2025-08-26 来源:本站 点击次数:41
近日，浙江省农科院亚热带作物研究所张培安助理研究员为第一作者、刘冬峰副研究员为通讯作者，在《BMC Plant Biology》杂志发表题为“Identification of key genes controlling anthocyanin biosynthesis in the fruits of a bud variety of Tarocco blood-orange”的研究论文，研究聚焦中国常见的血橙（芸香科柑橘属）品种Tarocco及其在温州发现的芽变品种Ouya（MT），讨论了MT果实中花青素生物合成受抑制的品质特性及分子机制。研究结果表明，MT果实具有更优的糖酸比、更大的果实重量和尺寸，且成熟期比WT提前约1个月，具备较高的推广价值。在分子水平上，研究人员鉴定出多个与花青素合成相关的差异表达基因、转录因子和甲基化相关基因，并通过WGBS+RNA-seq联合分析，验证了DNA甲基化在花青素积累中的调控作用。这些发现不仅为血橙果实品质改良提供了新的基因资源和靶点，也为其他柑橘品种的遗传改良提供参考。
研究人员收集了Tarocco（野生型，WT）和芽变品种Ouya（MT）的果实，共九个发育阶段，检测其花青素、可溶性糖和有机酸含量，并在三个发育阶段对转录组和代谢物进行分析。分析结果表明，MT是一个新的花青素含量低、糖酸比优于WT的血橙品种。与WT果实相比，MT果实中花青素的含量显著降低，尤其是矢车菊素类花青素（cyanidin-like anthocyanins），而黄酮类化合物含量没有显著变化。在WT和MT的三个果实发育阶段，共鉴定出64个差异表达基因（DEGs），包括5个转录因子（TFs）、5个甲基化相关基因和1个黄酮类生物合成基因。进一步利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建这些TFs的潜在调控网络。此外，经5-氮杂胞苷（5-aza）处理的MT果实果肉中，积累的花青素以及一些花青素合成相关基因的启动子和基因区域存在低甲基化。这些结果为研究DNA甲基化对MT果实中花青素积累的作用提供了新的见解，并为推广MT作为一个新品种提供支持。
易小结
该研究通过WGBS+RNA-seq技术联合分析，深入探究了MT果实中花青素合成受抑制的分子机制。不仅为理解DNA甲基化对MT果实花青素积累的影响提供了新见解，而且为MT作为一种新的血橙品种的推广提供了支持。
WGBS分析揭示了DNA甲基化在花青素合成相关基因调控中的重要作用，而RNA-seq则鉴定出多个与花青素合成相关的差异表达基因、转录因子和甲基化相关基因。这些发现不仅为血橙果实品质改良提供了新的基因资源和靶点，也为其他柑橘品种的遗传改良提供了参考。此外，本研究还强调了WGBS+RNA-seq技术在揭示植物次生代谢产物生物合成和调控机制中的重要作用，为未来类似作物研究提供了有力的技术支持和应用范例，有助于挖掘更多与果实品质相关的基因和调控元件，推动农作物产业的可持续发展。
研究方法
植物材料：收集WT和MT果实样本，每15天采集一次，共采集九个样本，每个样本包含10个果实。
外观性状分析：果实重量和尺寸；果皮和果肉颜色参数。
理化性质检测：可溶性固形物、可溶性糖、有机酸、维生素C和总类胡萝卜素含量；总花青素及其组分含量分析。
转录组测序（RNA-seq）：从开花后（days after flowering，DAF）235、265和280天收集的WT和MT果肉中提取总RNA，分别命名为WT1 / MT1、WT2 / MT2和WT3 / MT3并进行高通量测序，每个文库包含40.8-85.2M的clean reads，与参考基因组比对，筛选出DEGs，并进行KEGG和GO富集分析。
WGCNA分析：构建共表达网络，设置相关参数后进行网络构建、模块和基因选择以及模块基因的功能分析。通过模块特征基因与样本性状的相关性分析，筛选出与花青素含量和果实品质性状相关的模块。
全基因组亚硫酸盐测序分析（WGBS）+RNA-seq：经5-aza处理235DAF收集MT果实，处理7天后，将果实切成两半，取果肉样本进行RNA-seq和WGBS分析，分析其DNA甲基化水平和基因表达变化之间的关系。
结果图形
（1）理化性质
在160-235 DAF期间，WT果实的果皮颜色比MT果实更橙红，而220 DAF之前，两种品种的果肉颜色相似，均未检测到花青素积累。220 DAF后，MT果肉颜色显著浅于WT，WT果皮边缘开始变红，随后红色逐渐向中心扩散，到280 DAF时，整个果肉呈丝状红色，而MT仅边缘有红色。果皮和果肉的颜色参数在不同发育阶段表现出显著差异，反映了两种品种果实颜色的变化。
在果实重量、尺寸、可溶性固形物（TSS）、可溶性糖和有机酸含量方面，MT果实的直径和重量均显著大于WT，280 DAF时MT果实重量为254.08g，WT为242.36g。MT的TSS含量在190DAF时超过15°Brix，而WT仅为12.91°Brix，且随着果实成熟，MT的TSS、可溶性糖含量均显著高于WT，而有机酸含量则相反，尤其是柠檬酸，导致MT的糖酸比在190 DAF后显著高于WT。此外，280 DAF时，两种品种果实果肉中的维生素C含量差异不显著，但WT的类胡萝卜素含量显著高于MT。
图1：Tarocco（WT）及其芽变品种（MT）在不同发育阶段的外观（A）及果皮和果肉中总花青素含量（B）。
（2）总花青素及其组分含量变化
两种品种果实果皮和果肉中总花青素含量的变化趋势与果实外观变化相似，220 DAF之前未检测到花青素。随着果实成熟，果肉中总花青素含量相对较低，且在220和235 DAF时两类品种间无显著差异。从250 DAF到280 DAF，WT果实的果皮和果肉中总花青素含量均显著高于MT。在235、265和280 DAF收集的果肉样本中，共检测到38种花青素和6种黄烷酮，其中矢车菊素类花青素含量相对较高，且随着果实成熟，花青素含量在WT中显著高于MT。此外还检测到黄酮类化合物含量在WT中也显著高于MT。在不同组间比较花青素和黄酮类化合物的数量，发现235 DAF时WT和MT果实间有4种差异代谢物，265 DAF时有7种，280 DAF时有19种。在相同品种中，与235DAF相比，265 DAF和280 DAF大多数（分别为11种和9种）差异代谢物在WT和MT中共同差异合成。
图2：不同发育阶段 Tarocco（WT）及其芽变品种（MT）果肉中花青素组分热图（A）和维恩图（B-D）。
表1：不同采样时期WT和MT果肉中主要花青素和黄酮类化合物含量（µg·g⁻¹）。
（3）不同发育阶段WT和MT果实的RNA-seq分析
为分析WT和MT果实花青素合成差异的分子机制，研究人员对检测到花青素组分样本进行RNA-seq分析。样本间相关性分析显示三个生物学重复间具有良好的可重复性，WT1和WT2间变异性最小，而WT1、MT3、MT1和WT3间差异相对较大。在三个时间点的WT和MT组间进行比较，235 DAF时鉴定出321个DEGs，265 DAF时有734个，280 DAF时有816个，表明随着果实成熟，两种品种间DEGs数量逐渐增加。在这些DEGs中，有64个基因在三个比较组中存在交集，KEGG分析显示这些交集基因富集在黄酮类生物合成、苯丙素生物合成以及黄酮和黄酮醇生物合成通路中，GO分析则显示在五个与甲基化相关的DEGs中富集，且这些DEGs在WT中的表达量均高于MT。
图3：鉴定并分析Tarocco（WT）和其芽变品种（MT）果肉样本之间DEGs的功能特征。对以下各组DEGs进行KEGG富集分析：（A）WT 1 与 MT 1，（B）WT 2 与 MT 2，（C）WT 3 与 MT 3；（D）维恩图展示三个比较组果肉样本之间共有和特异性基因；（E）对三个比较组中共有的64个DEGs进行KEGG分析。
（4）与花青素和果实品质性状相关的WGCNA模块鉴定
通过WGCNA，研究人员将基于13个性状（包括不同花青素组分、可溶性糖和有机酸）的9,571个基因进行分组，构建了7个模块，分别用不同颜色表示。其中，蓝色模块与花青素合成相关性最高，与总花青素和四种特定花青素组分高度相关，且富集在黄酮类生物合成、苯丙素生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、花青素生物合成以及苯丙氨酸代谢等代谢通路中；黄色模块与总花青素和特定花青素组分呈负相关，但也富集在花青素合成相关途径以及光合作用相关通路中。所有在WT和MT间差异表达的转录因子（TFs）被分类到不同模块中，蓝色模块在三个阶段中差异表达的TFs数量最多，且在三个阶段中鉴定出的五个TFs均位于蓝色模块中，表明蓝色模块中的某些DEGs可能是导致WT和MT果实花青素差异积累的关键因子。研究人员将这五个TFs作为中心基因，分析了其与蓝色模块中黄酮类合成相关基因的调控关联，分析结果表明CsATHB40、CsUNE10和CsRuby可以作为调控蛋白进行自我调控转录，并且CsUNE10和CsRuby可以相互调控，还可以参与调控蓝色模块中的黄酮类合成相关基因，如CsPAL1、CsAOC、Cs4CL1、Cs4CL2、CsCHS、CsCHI和CsCOMT。
图4：基于13个性状（不同花青素组分、可溶性糖和有机酸）表现，对9571个基因进行WGCNA分组。
（A）左侧显示7个模块及其包含的基因数量。右侧颜色表示特定模块与处理之间的相关系数。
（B-C）KEGG分析显示，与总花青素性状相关性最高的正模块（蓝，B）和负模块（黄，C）中的基因。
（D）转录组共表达网络分析展示WGCNA筛选出的模块中涉及的转录因子和结构基因。
（5）5-aza处理后的基因表达和DNA甲基化变化
5-aza处理后，MT果实果肉中检测到花青素的显著积累。通过比较5-aza处理和对照（CK）样本的RNA-seq，共鉴定出1,657个DEGs，其中661个上调，996个下调。KEGG富集分析显示，这些DEGs在与花青素合成相关的苯丙素生物合成和黄酮类生物合成通路中富集。此外，GO富集分析显示，几丁质和外部包被结构合成类别分别在上调和下调基因中富集。在5-aza处理后，与花青素合成相关的结构基因（CsPAL、CsC4H、Cs4CL、CsCHS、CsF3H、CsF3'5'H、CsF3'H、CsDFR和CsANS）的表达水平以及转录因子（CsWD40和CsAN1）的表达水平均显著提高，但CsRuby表达未检测到显著变化。研究人员对5-aza处理组和CK组进行了WGBS分析，每个样本获得＞50.93M clean reads（6.63Gb）。比较CK和5-aza处理样本之间的DNA甲基化变化模式，发现CK组中CG和CHG甲基化的比例分别为12.94%和15.52%，而CHH甲基化比例相对较低。此外，在所有CG、CHG和CHH甲基化中，与CK样本相比，在5-aza处理样本中，基因的5'和3'区域（±2K序列）的DNA甲基化水平降低，尤其是在基因启动子和基因体区域。分析CK和5 - aza组之间的差异甲基化区域（DMRs）显示，在CG、CHG和CHH的所有背景下，高甲基化DMRs数量均高于低甲基化DMRs，且在启动子和外显子中最为显著。KEGG分析显示，CG的DMRs在黄酮类生物合成通路中富集。这些结果表明，5-aza处理通过降低花青素合成相关基因的启动子和基因体区域的DNA甲基化水平，促进了MT果实果肉中花青素积累。
图5：基于WGBS分析的芽变品种（MT）在5-aza处理后花青素含量、基因表达和甲基化水平的变化。（A-B） 5-aza处理后果肉表型和花青素含量的变化。
（C） 利用RNA-seq分析5-aza和CK果肉中的DEGs。
（D） 这些DEGs的KEGG富集分析。
（E） 5-aza和CK处理后果肉中花青素相关基因的表达水平。
（F） 合并的CG、CHG和CHH（包括基因体及±2kb区域）的DNA甲基化图谱。
（G） 合并的CG、CHG和CHH（3'UTR、5'UTR、外显子和启动子）的DMR数。
（H） 花青素相关基因（CsCHI、CsUDPG、CsC4H、Cs4CL和CsPAL）启动子和基因体区域的甲基化水平可视化。Hyper，高甲基化；Hypo，低甲基化。
参考文献：
Zhang, P., Zhao, Q., Song, Y. et al. Identification of key genes controlling anthocyanin biosynthesis in the fruits of a bud variety of Tarocco blood-orange. BMC Plant Biol 25, 230 (2025). Doi:0.1186/s12870-025-06212-7.
研究人员收集了Tarocco（野生型，WT）和芽变品种Ouya（MT）的果实，共九个发育阶段，检测其花青素、可溶性糖和有机酸含量，并在三个发育阶段对转录组和代谢物进行分析。分析结果表明，MT是一个新的花青素含量低、糖酸比优于WT的血橙品种。与WT果实相比，MT果实中花青素的含量显著降低，尤其是矢车菊素类花青素（cyanidin-like anthocyanins），而黄酮类化合物含量没有显著变化。在WT和MT的三个果实发育阶段，共鉴定出64个差异表达基因（DEGs），包括5个转录因子（TFs）、5个甲基化相关基因和1个黄酮类生物合成基因。进一步利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建这些TFs的潜在调控网络。此外，经5-氮杂胞苷（5-aza）处理的MT果实果肉中，积累的花青素以及一些花青素合成相关基因的启动子和基因区域存在低甲基化。这些结果为研究DNA甲基化对MT果实中花青素积累的作用提供了新的见解，并为推广MT作为一个新品种提供支持。
图形摘要：血橙果实色泽变化机制比较
易小结
该研究通过WGBS+RNA-seq技术联合分析，深入探究了MT果实中花青素合成受抑制的分子机制。不仅为理解DNA甲基化对MT果实花青素积累的影响提供了新见解，而且为MT作为一种新的血橙品种的推广提供了支持。
WGBS分析揭示了DNA甲基化在花青素合成相关基因调控中的重要作用，而RNA-seq则鉴定出多个与花青素合成相关的差异表达基因、转录因子和甲基化相关基因。这些发现不仅为血橙果实品质改良提供了新的基因资源和靶点，也为其他柑橘品种的遗传改良提供了参考。此外，本研究还强调了WGBS+RNA-seq技术在揭示植物次生代谢产物生物合成和调控机制中的重要作用，为未来类似作物研究提供了有力的技术支持和应用范例，有助于挖掘更多与果实品质相关的基因和调控元件，推动农作物产业的可持续发展。
研究方法
植物材料：收集WT和MT果实样本，每15天采集一次，共采集九个样本，每个样本包含10个果实。
外观性状分析：果实重量和尺寸；果皮和果肉颜色参数。
理化性质检测：可溶性固形物、可溶性糖、有机酸、维生素C和总类胡萝卜素含量；总花青素及其组分含量分析。
转录组测序（RNA-seq）：从开花后（days after flowering，DAF）235、265和280天收集的WT和MT果肉中提取总RNA，分别命名为WT1 / MT1、WT2 / MT2和WT3 / MT3并进行高通量测序，每个文库包含40.8-85.2M的clean reads，与参考基因组比对，筛选出DEGs，并进行KEGG和GO富集分析。
WGCNA分析：构建共表达网络，设置相关参数后进行网络构建、模块和基因选择以及模块基因的功能分析。通过模块特征基因与样本性状的相关性分析，筛选出与花青素含量和果实品质性状相关的模块。
全基因组亚硫酸盐测序分析（WGBS）+RNA-seq：经5-aza处理235DAF收集MT果实，处理7天后，将果实切成两半，取果肉样本进行RNA-seq和WGBS分析，分析其DNA甲基化水平和基因表达变化之间的关系。
结果图形
（1）理化性质
在160-235 DAF期间，WT果实的果皮颜色比MT果实更橙红，而220 DAF之前，两种品种的果肉颜色相似，均未检测到花青素积累。220 DAF后，MT果肉颜色显著浅于WT，WT果皮边缘开始变红，随后红色逐渐向中心扩散，到280 DAF时，整个果肉呈丝状红色，而MT仅边缘有红色。果皮和果肉的颜色参数在不同发育阶段表现出显著差异，反映了两种品种果实颜色的变化。
在果实重量、尺寸、可溶性固形物（TSS）、可溶性糖和有机酸含量方面，MT果实的直径和重量均显著大于WT，280 DAF时MT果实重量为254.08g，WT为242.36g。MT的TSS含量在190DAF时超过15°Brix，而WT仅为12.91°Brix，且随着果实成熟，MT的TSS、可溶性糖含量均显著高于WT，而有机酸含量则相反，尤其是柠檬酸，导致MT的糖酸比在190 DAF后显著高于WT。此外，280 DAF时，两种品种果实果肉中的维生素C含量差异不显著，但WT的类胡萝卜素含量显著高于MT。
图1：Tarocco（WT）及其芽变品种（MT）在不同发育阶段的外观（A）及果皮和果肉中总花青素含量（B）。
（2）总花青素及其组分含量变化
两种品种果实果皮和果肉中总花青素含量的变化趋势与果实外观变化相似，220 DAF之前未检测到花青素。随着果实成熟，果肉中总花青素含量相对较低，且在220和235 DAF时两类品种间无显著差异。从250 DAF到280 DAF，WT果实的果皮和果肉中总花青素含量均显著高于MT。在235、265和280 DAF收集的果肉样本中，共检测到38种花青素和6种黄烷酮，其中矢车菊素类花青素含量相对较高，且随着果实成熟，花青素含量在WT中显著高于MT。此外还检测到黄酮类化合物含量在WT中也显著高于MT。在不同组间比较花青素和黄酮类化合物的数量，发现235 DAF时WT和MT果实间有4种差异代谢物，265 DAF时有7种，280 DAF时有19种。在相同品种中，与235DAF相比，265 DAF和280 DAF大多数（分别为11种和9种）差异代谢物在WT和MT中共同差异合成。
图2：不同发育阶段 Tarocco（WT）及其芽变品种（MT）果肉中花青素组分热图（A）和维恩图（B-D）。
表1：不同采样时期WT和MT果肉中主要花青素和黄酮类化合物含量（µg·g⁻¹）。
（3）不同发育阶段WT和MT果实的RNA-seq分析
为分析WT和MT果实花青素合成差异的分子机制，研究人员对检测到花青素组分样本进行RNA-seq分析。样本间相关性分析显示三个生物学重复间具有良好的可重复性，WT1和WT2间变异性最小，而WT1、MT3、MT1和WT3间差异相对较大。在三个时间点的WT和MT组间进行比较，235 DAF时鉴定出321个DEGs，265 DAF时有734个，280 DAF时有816个，表明随着果实成熟，两种品种间DEGs数量逐渐增加。在这些DEGs中，有64个基因在三个比较组中存在交集，KEGG分析显示这些交集基因富集在黄酮类生物合成、苯丙素生物合成以及黄酮和黄酮醇生物合成通路中，GO分析则显示在五个与甲基化相关的DEGs中富集，且这些DEGs在WT中的表达量均高于MT。
图3：鉴定并分析Tarocco（WT）和其芽变品种（MT）果肉样本之间DEGs的功能特征。对以下各组DEGs进行KEGG富集分析：（A）WT 1 与 MT 1，（B）WT 2 与 MT 2，（C）WT 3 与 MT 3；（D）维恩图展示三个比较组果肉样本之间共有和特异性基因；（E）对三个比较组中共有的64个DEGs进行KEGG分析。
（4）与花青素和果实品质性状相关的WGCNA模块鉴定
通过WGCNA，研究人员将基于13个性状（包括不同花青素组分、可溶性糖和有机酸）的9,571个基因进行分组，构建了7个模块，分别用不同颜色表示。其中，蓝色模块与花青素合成相关性最高，与总花青素和四种特定花青素组分高度相关，且富集在黄酮类生物合成、苯丙素生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、花青素生物合成以及苯丙氨酸代谢等代谢通路中；黄色模块与总花青素和特定花青素组分呈负相关，但也富集在花青素合成相关途径以及光合作用相关通路中。所有在WT和MT间差异表达的转录因子（TFs）被分类到不同模块中，蓝色模块在三个阶段中差异表达的TFs数量最多，且在三个阶段中鉴定出的五个TFs均位于蓝色模块中，表明蓝色模块中的某些DEGs可能是导致WT和MT果实花青素差异积累的关键因子。研究人员将这五个TFs作为中心基因，分析了其与蓝色模块中黄酮类合成相关基因的调控关联，分析结果表明CsATHB40、CsUNE10和CsRuby可以作为调控蛋白进行自我调控转录，并且CsUNE10和CsRuby可以相互调控，还可以参与调控蓝色模块中的黄酮类合成相关基因，如CsPAL1、CsAOC、Cs4CL1、Cs4CL2、CsCHS、CsCHI和CsCOMT。
（A）左侧显示7个模块及其包含的基因数量。右侧颜色表示特定模块与处理之间的相关系数。
（B-C）KEGG分析显示，与总花青素性状相关性最高的正模块（蓝，B）和负模块（黄，C）中的基因。
（D）转录组共表达网络分析展示WGCNA筛选出的模块中涉及的转录因子和结构基因。
（5）5-aza处理后的基因表达和DNA甲基化变化
5-aza处理后，MT果实果肉中检测到花青素的显著积累。通过比较5-aza处理和对照（CK）样本的RNA-seq，共鉴定出1,657个DEGs，其中661个上调，996个下调。KEGG富集分析显示，这些DEGs在与花青素合成相关的苯丙素生物合成和黄酮类生物合成通路中富集。此外，GO富集分析显示，几丁质和外部包被结构合成类别分别在上调和下调基因中富集。在5-aza处理后，与花青素合成相关的结构基因（CsPAL、CsC4H、Cs4CL、CsCHS、CsF3H、CsF3'5'H、CsF3'H、CsDFR和CsANS）的表达水平以及转录因子（CsWD40和CsAN1）的表达水平均显著提高，但CsRuby表达未检测到显著变化。研究人员对5-aza处理组和CK组进行了WGBS分析，每个样本获得＞50.93M clean reads（6.63Gb）。比较CK和5-aza处理样本之间的DNA甲基化变化模式，发现CK组中CG和CHG甲基化的比例分别为12.94%和15.52%，而CHH甲基化比例相对较低。此外，在所有CG、CHG和CHH甲基化中，与CK样本相比，在5-aza处理样本中，基因的5'和3'区域（±2K序列）的DNA甲基化水平降低，尤其是在基因启动子和基因体区域。分析CK和5 - aza组之间的差异甲基化区域（DMRs）显示，在CG、CHG和CHH的所有背景下，高甲基化DMRs数量均高于低甲基化DMRs，且在启动子和外显子中最为显著。KEGG分析显示，CG的DMRs在黄酮类生物合成通路中富集。这些结果表明，5-aza处理通过降低花青素合成相关基因的启动子和基因体区域的DNA甲基化水平，促进了MT果实果肉中花青素积累。
图5：基于WGBS分析的芽变品种（MT）在5-aza处理后花青素含量、基因表达和甲基化水平的变化。（A-B） 5-aza处理后果肉表型和花青素含量的变化。
（D） 这些DEGs的KEGG富集分析。
（E） 5-aza和CK处理后果肉中花青素相关基因的表达水平。
（F） 合并的CG、CHG和CHH（包括基因体及±2kb区域）的DNA甲基化图谱。
（G） 合并的CG、CHG和CHH（3'UTR、5'UTR、外显子和启动子）的DMR数。
（H） 花青素相关基因（CsCHI、CsUDPG、CsC4H、Cs4CL和CsPAL）启动子和基因体区域的甲基化水平可视化。Hyper，高甲基化；Hypo，低甲基化。
参考文献：
Zhang, P., Zhao, Q., Song, Y. et al. Identification of key genes controlling anthocyanin biosynthesis in the fruits of a bud variety of Tarocco blood-orange. BMC Plant Biol 25, 230 (2025). Doi:0.1186/s12870-025-06212-7.
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