多组学分析揭示坏死性小肠结肠炎(NEC)的新型DNA甲基化调控生物标志物
2025-08-14 来源:本站 点击次数:52
近日，南方医科大学第一临床医学院田博闻博士等为第一作者，广州市妇女儿童医疗中心Chaoting Lan、夏慧敏教授、钟微教授为共同通讯作者在《Inflammation》期刊发表了题为《Epigenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis: Unraveling Methylation-Regulated Biomarkers》的科研成果，研究通过多组学分析鉴定出坏死性小肠结肠炎（Necrotizing Enterocolitis, NEC）肠道组织中的新型甲基化调控生物标志物。研究首先分析了NEC患者回肠和结肠组织的DNA甲基化和转录组数据集，鉴定出多个甲基化相关差异基因（Methylation-Related Differentially Expressed Genes, MrDEGs），并通过单细胞数据和靶基因甲基化测序（Targeted Bisulfite Sequencing, TBS）技术验证这些基因在NEC中的潜在诊断价值。
发表期刊：Inflammation
影响因子：IF5/Q2
技术平台：靶基因甲基化测序（TBS）
坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种多因素引起的胃肠道疾病，在早产儿中具有较高的发病率和死亡率。本研究旨在通过多组学分析，鉴定出NEC肠道组织中的新型甲基化调控生物标志物。研究首先分析了NEC患者回肠和结肠组织的DNA甲基化和转录组数据集，揭示了启动子区域的甲基化水平与转录水平呈负相关，进而鉴定出甲基化相关差异基因（MrDEGs），这些基因包括ADAP1、GUCA2A、BCL2L14、FUT3、MISP、USH1C、ITGA3、UNC93A和IL22RA1。单细胞数据显示，这些MrDEGs主要位于肠道组织的肠道上皮区域。通过靶基因甲基化测序（TBS）和实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证这些MrDEGs，研究人员成功鉴定并验证了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP基因主要在肠道上皮绒毛细胞中表达。通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）揭示这些基因主要参与NEC中T细胞分化和抑制肠道炎症的病理过程。本研究加深了对NEC发病机制的理解，并可能推动NEC预测和诊断新的精准医疗方法发展。
研究方法
样本收集：共收集16份肠道组织样本，包括8份NEC患者的回肠组织样本和8份对照组样本。
数据来源：从GEO数据库中收集NEC的基因表达和DNA甲基化数据集，包括GSE212913（回肠）、GSE212997（结肠）和GSE46619（结肠和回肠）。单细胞数据来自Adi Egozi团队研究。
DNA甲基化数据分析：差异甲基化区域（DMRs）分析，并通过UCSC数据库进行基因组注释。
转录组数据分析：筛选差异表达基因（DEGs），并进行基因集富集分析（GSEA）。
单细胞数据分析：单细胞数据分析，过滤低质量细胞-基因，并进行UMAP降维分群。
免疫浸润分析：分析免疫细胞浸润情况。
靶基因甲基化测序（TBS）：对NEC患者和对照组回肠组织样本进行TBS验证，检测靶基因甲基化水平。
RT-qPCR：验证靶基因的RNA表达水平。
免疫荧光染色分析：检测NEC和对照组肠道组织中IL22RA1基因的表达差异。
结果图形
（1）结肠和回肠NEC病变中的DNA甲基化特征
研究发现，NEC患者的结肠和回肠组织中普遍存在高甲基化现象。在回肠中，共有357个区域的甲基化水平发生变化，其中262个区域甲基化水平增加，95个区域甲基化水平降低。结肠中甲基化水平变化的区域有1550个，其中994个区域甲基化水平增加，556个区域甲基化水平降低。甲基化区域主要位于启动子区域，结肠中启动子区域甲基化比例为45%（702/1550），回肠中为34.35%（123/357）。这些结果表明，NEC组织的高甲基化可能通过沉默下游基因表达介导疾病发生发展。
图2：GSE212997和GSE212913数据集中的人NEC中差异甲基化区域及GSE46619 数据集中人NEC 中差异表达基因。
a-b. 人NEC组和对照组（CTRL）样本中DMRs散点图。横轴表示NEC和CTRL的平均甲基化水平，纵轴表示两组甲基化水平差异。红色点代表显著上调的区域，蓝色点表示显著下调的区域。
c-d. 不同区域（启动子、外显子、内含子、基因间区、3’UTR 和远端基因间区）DMRs 比例扇形图。
e. 与NEC标志基因相关DEGs火山图。
f. DEGs 的GSEA分析。
g. 免疫浸润分析预测免疫细胞比例箱线图。纵轴表示免疫细胞的富集水平，横轴表示每种免疫细胞名称。
（2）NEC转录组数据的免疫学特征
通过对GSE46619转录组数据集分析，揭示了NEC样本中共有1,693个差异表达基因（DEGs），其中499个上调基因和1,194个下调基因。这些基因包括已知的NEC标志基因，如TLR4、CXCL8、PLA2G7、HBEGF和FABP2。通过GSEA分析揭示了与NEC相关的基因集主要参与免疫炎症通路，如NF-κB信号通路、IL-17信号通路和TNF信号通路。免疫浸润分析显示，NEC组中激活的树突状细胞、效应记忆CD4+ T细胞、未成熟树突状细胞（immature dendritic cells）、巨噬细胞（macrophages）、肥大细胞（mast cells）、髓源性抑制细胞(MDSCs)、NKT细胞(Natural killer T cell)、中性粒细胞（neutrophils,）、浆细胞树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells）、调节性T细胞、T滤泡辅助细胞、Th1细胞和Th17细胞数量与对照组存在显著差异（图2g）。这些结果表明，免疫细胞过度激活在NEC的发生中发挥重要作用。
（3）NEC中MrDEG的多组学联合分析
研究通过结合DNA甲基化和转录组分析结果筛选出9个甲基化调控基因，包括ADAP1、GUCA2A、BCL2L14、FUT3、MISP、USH1C、ITGA3、IL22RA1和UNC93A。这些基因在NEC组织中DNA甲基化水平升高和RNA表达水平降低。单细胞数据分析显示，这些基因主要在肠道上皮细胞中表达，尤其是肠绒毛细胞。通过靶基因甲基化测序（TBS）和RT-qPCR验证，验证了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP这4个基因的甲基化水平与RNA表达水平呈负相关，表明其可能是NEC的潜在生物标志物。
b-c. ADAP1/GUCA2A的甲基化区域比对到到基因组上的UCSC基因组浏览器图。黑色区域表示高甲基化位置，条形图显示NEC组与对照组的平均甲基化水平。
d. 按细胞类型分类的单细胞图谱。
e. 按疾病分类的单细胞图。
f. 点图显示按细胞类型分类的MrDEGs。
g. 由MrDEGs着色的UMAP图。
（4）验证MrDEG DNA甲基化和转录组水平
研究通过TBS技术对NEC患者和对照组的回肠组织样本进行甲基化水平检测，检测结果揭示ADAP1、GUCA2A、IL22RA1、MISP、UNC93A和USH1C基因在NEC组织中的甲基化水平显著升高。RT-qPCR结果表明，这些基因在NEC组织中的RNA表达水平显著降低。这些结果进一步验证这些基因在NEC中的甲基化调控作用。
（5）MrDEG 功能预测
通过单细胞数据分析结果揭示了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP主要在肠道上皮细胞的肠绒毛细胞中表达。HE染色结果显示，NEC组织的肠绒毛结构严重受损。通过GSEA分析揭示这些基因的低表达与TNF信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路和Toll样受体信号通路的过度激活有关。这些通路过度激活可能导致肠道细胞炎症反应加剧，从而加重NEC病理过程。
讨论和启示
本研究通过多组学分析，揭示了NEC中DNA甲基化的调控机制，并鉴定出多个潜在的甲基化调控生物标志物。这些生物标志物在NEC的早期诊断和精准医疗中具有重要的应用前景。此外，研究还探讨了这些生物标志物在NEC病理过程中的作用机制，为未来开发新的治疗策略提供了理论基础。未来的研究需要在更大的临床样本中验证这些发现，并进一步探索这些生物标志物在NEC发病机制中的具体作用。
靶基因甲基化测序分析（TBS）在本研究中发挥了重要作用。TBS技术通过检测靶基因甲基化水平，为研究NEC中的DNA甲基化调控机制提供了直接证据。TBS技术的单碱基分辨率和高灵敏度使其能够准确检测到NEC组织中基因启动子区域的甲基化变化，从而揭示了这些基因在NEC中的潜在调控作用。未来类似标志物筛选验证研究中，TBS技术可以作为一种重要的工具，用于验证和筛选潜在的甲基化调控生物标志物，为疾病的早期诊断和治疗提供新思路。
参考文献：
Tian B, Xu X, Li L, Tian Y, Liu Y, Mu Y, Lu J, Song K, Lv J, He Q, Zhong W, Xia H, Lan C. Epigenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis: Unraveling Methylation-Regulated Biomarkers. Inflammation. 2024 May 30. doi: 10.1007/s10753-024-02054-x.
标题：Epigenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis: Unraveling Methylation-Regulated Biomarkers（坏死性小肠结肠炎的表观遗传学见解：揭示甲基化调控的生物标志物）
发表时间：2025年2月发表期刊：Inflammation
影响因子：IF5/Q2
技术平台：靶基因甲基化测序（TBS）
坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种多因素引起的胃肠道疾病，在早产儿中具有较高的发病率和死亡率。本研究旨在通过多组学分析，鉴定出NEC肠道组织中的新型甲基化调控生物标志物。研究首先分析了NEC患者回肠和结肠组织的DNA甲基化和转录组数据集，揭示了启动子区域的甲基化水平与转录水平呈负相关，进而鉴定出甲基化相关差异基因（MrDEGs），这些基因包括ADAP1、GUCA2A、BCL2L14、FUT3、MISP、USH1C、ITGA3、UNC93A和IL22RA1。单细胞数据显示，这些MrDEGs主要位于肠道组织的肠道上皮区域。通过靶基因甲基化测序（TBS）和实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证这些MrDEGs，研究人员成功鉴定并验证了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP基因主要在肠道上皮绒毛细胞中表达。通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）揭示这些基因主要参与NEC中T细胞分化和抑制肠道炎症的病理过程。本研究加深了对NEC发病机制的理解，并可能推动NEC预测和诊断新的精准医疗方法发展。
研究方法
样本收集：共收集16份肠道组织样本，包括8份NEC患者的回肠组织样本和8份对照组样本。
数据来源：从GEO数据库中收集NEC的基因表达和DNA甲基化数据集，包括GSE212913（回肠）、GSE212997（结肠）和GSE46619（结肠和回肠）。单细胞数据来自Adi Egozi团队研究。
DNA甲基化数据分析：差异甲基化区域（DMRs）分析，并通过UCSC数据库进行基因组注释。
转录组数据分析：筛选差异表达基因（DEGs），并进行基因集富集分析（GSEA）。
单细胞数据分析：单细胞数据分析，过滤低质量细胞-基因，并进行UMAP降维分群。
免疫浸润分析：分析免疫细胞浸润情况。
靶基因甲基化测序（TBS）：对NEC患者和对照组回肠组织样本进行TBS验证，检测靶基因甲基化水平。
RT-qPCR：验证靶基因的RNA表达水平。
免疫荧光染色分析：检测NEC和对照组肠道组织中IL22RA1基因的表达差异。
图1：本研究分析流程
结果图形
（1）结肠和回肠NEC病变中的DNA甲基化特征
研究发现，NEC患者的结肠和回肠组织中普遍存在高甲基化现象。在回肠中，共有357个区域的甲基化水平发生变化，其中262个区域甲基化水平增加，95个区域甲基化水平降低。结肠中甲基化水平变化的区域有1550个，其中994个区域甲基化水平增加，556个区域甲基化水平降低。甲基化区域主要位于启动子区域，结肠中启动子区域甲基化比例为45%（702/1550），回肠中为34.35%（123/357）。这些结果表明，NEC组织的高甲基化可能通过沉默下游基因表达介导疾病发生发展。
a-b. 人NEC组和对照组（CTRL）样本中DMRs散点图。横轴表示NEC和CTRL的平均甲基化水平，纵轴表示两组甲基化水平差异。红色点代表显著上调的区域，蓝色点表示显著下调的区域。
c-d. 不同区域（启动子、外显子、内含子、基因间区、3’UTR 和远端基因间区）DMRs 比例扇形图。
e. 与NEC标志基因相关DEGs火山图。
f. DEGs 的GSEA分析。
g. 免疫浸润分析预测免疫细胞比例箱线图。纵轴表示免疫细胞的富集水平，横轴表示每种免疫细胞名称。
（2）NEC转录组数据的免疫学特征
通过对GSE46619转录组数据集分析，揭示了NEC样本中共有1,693个差异表达基因（DEGs），其中499个上调基因和1,194个下调基因。这些基因包括已知的NEC标志基因，如TLR4、CXCL8、PLA2G7、HBEGF和FABP2。通过GSEA分析揭示了与NEC相关的基因集主要参与免疫炎症通路，如NF-κB信号通路、IL-17信号通路和TNF信号通路。免疫浸润分析显示，NEC组中激活的树突状细胞、效应记忆CD4+ T细胞、未成熟树突状细胞（immature dendritic cells）、巨噬细胞（macrophages）、肥大细胞（mast cells）、髓源性抑制细胞(MDSCs)、NKT细胞(Natural killer T cell)、中性粒细胞（neutrophils,）、浆细胞树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells）、调节性T细胞、T滤泡辅助细胞、Th1细胞和Th17细胞数量与对照组存在显著差异（图2g）。这些结果表明，免疫细胞过度激活在NEC的发生中发挥重要作用。
（3）NEC中MrDEG的多组学联合分析
研究通过结合DNA甲基化和转录组分析结果筛选出9个甲基化调控基因，包括ADAP1、GUCA2A、BCL2L14、FUT3、MISP、USH1C、ITGA3、IL22RA1和UNC93A。这些基因在NEC组织中DNA甲基化水平升高和RNA表达水平降低。单细胞数据分析显示，这些基因主要在肠道上皮细胞中表达，尤其是肠绒毛细胞。通过靶基因甲基化测序（TBS）和RT-qPCR验证，验证了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP这4个基因的甲基化水平与RNA表达水平呈负相关，表明其可能是NEC的潜在生物标志物。
图3：筛选甲基化相关差异基因（MrDEGs）并分析其在NEC单细胞数据集中的定位。
a. 不同肠道部位甲基化相关基因上调或下调基因UpSet图。b-c. ADAP1/GUCA2A的甲基化区域比对到到基因组上的UCSC基因组浏览器图。黑色区域表示高甲基化位置，条形图显示NEC组与对照组的平均甲基化水平。
d. 按细胞类型分类的单细胞图谱。
e. 按疾病分类的单细胞图。
f. 点图显示按细胞类型分类的MrDEGs。
g. 由MrDEGs着色的UMAP图。
（4）验证MrDEG DNA甲基化和转录组水平
研究通过TBS技术对NEC患者和对照组的回肠组织样本进行甲基化水平检测，检测结果揭示ADAP1、GUCA2A、IL22RA1、MISP、UNC93A和USH1C基因在NEC组织中的甲基化水平显著升高。RT-qPCR结果表明，这些基因在NEC组织中的RNA表达水平显著降低。这些结果进一步验证这些基因在NEC中的甲基化调控作用。
图4：在人组织样本中验证甲基化相关差异基因（MrDEGs）的甲基化水平和RNA表达。
- MrDEGs甲基化水平可视化。热图显示CpG岛的甲基化水平，右侧指示该CpG岛测序的起始位置。
- 显示MrDEGs甲基化水平差异直方图。
- NEC患者中甲基化相关基因的mRNA表达水平。
（5）MrDEG 功能预测
通过单细胞数据分析结果揭示了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP主要在肠道上皮细胞的肠绒毛细胞中表达。HE染色结果显示，NEC组织的肠绒毛结构严重受损。通过GSEA分析揭示这些基因的低表达与TNF信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路和Toll样受体信号通路的过度激活有关。这些通路过度激活可能导致肠道细胞炎症反应加剧，从而加重NEC病理过程。
图5：通过单细胞数据和单基因GSEA分析预测MrDEGs定位和作用。
- 按细胞类型分类的肠上皮细胞簇的重新聚类图谱。
- 按疾病分类的肠上皮细胞簇的重新聚类图谱。
- 由MrDEGs着色的UMAP图。
- H&E染色实验分析NEC组和对照组肠绒毛结构的病理变化，
讨论和启示
本研究通过多组学分析，揭示了NEC中DNA甲基化的调控机制，并鉴定出多个潜在的甲基化调控生物标志物。这些生物标志物在NEC的早期诊断和精准医疗中具有重要的应用前景。此外，研究还探讨了这些生物标志物在NEC病理过程中的作用机制，为未来开发新的治疗策略提供了理论基础。未来的研究需要在更大的临床样本中验证这些发现，并进一步探索这些生物标志物在NEC发病机制中的具体作用。
图6：甲基化相关差异基因（MrDEGs）筛选过程及其作用机制示意图。
靶基因甲基化测序分析（TBS）在本研究中发挥了重要作用。TBS技术通过检测靶基因甲基化水平，为研究NEC中的DNA甲基化调控机制提供了直接证据。TBS技术的单碱基分辨率和高灵敏度使其能够准确检测到NEC组织中基因启动子区域的甲基化变化，从而揭示了这些基因在NEC中的潜在调控作用。未来类似标志物筛选验证研究中，TBS技术可以作为一种重要的工具，用于验证和筛选潜在的甲基化调控生物标志物，为疾病的早期诊断和治疗提供新思路。
参考文献：
Tian B, Xu X, Li L, Tian Y, Liu Y, Mu Y, Lu J, Song K, Lv J, He Q, Zhong W, Xia H, Lan C. Epigenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis: Unraveling Methylation-Regulated Biomarkers. Inflammation. 2024 May 30. doi: 10.1007/s10753-024-02054-x.
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