期刊：Nature Immunology
影响因子：29.6
主要技术：scRNA-seq、ST

导语
在免疫介导的炎症性疾病（IMIDs）中，成纤维细胞的活化是众所周知的，成纤维细胞参与免疫细胞的募集和活化，并参与组织破坏，从而导致炎症的慢性化。最近开发的针对成纤维细胞活化蛋白（FAP）的高度特异性的小分子抑制剂，使得通过正电子发射断层扫描（PET）成像在 IMIDs 中检测人体成纤维细胞活性成为可能。目前尚不清楚抗炎治疗期间成纤维细胞活化是如何改变的，有证据表明，尽管炎症消退，但 IMIDs 中的成纤维细胞仍保持活化状态。在此，作者展示了在关节炎消退期间成纤维细胞被重新编程为抗炎表型，这影响了 FAP 的内化，从而影响 PET 成像。在活动性关节炎中，检测到具有高 FAP 内化的促炎性 MMP3+/IL6+成纤维细胞与促炎性免疫细胞聚集在一起。在消退期间，具有低 FAP 内化的 CD200+/DKK3+成纤维细胞积累，导致 PET 信号降低。它们与诸如 2 型固有淋巴细胞（ILC2）等促消退免疫细胞聚集在一起，并通过 CD200/CD200R1 稳定了 ILC2 的表型。总之，这些数据表明在关节炎消退期间间质细胞区室存在动态分子重编程，并揭示了成纤维细胞此前未被探索的抗炎功能。

关键技术
scRNA-seq、ST

实验结果
1. FAP检测与关节炎患者的疾病活动相关
为了检测、表征和监测关节炎中的间充质细胞反应，作者开发了一种在人体内测量关节中成纤维细胞活化蛋白（FAP）活化的技术。为此，作者使用特异性结合活化间充质细胞表达的 FAP 的示踪剂 Ga-FAPI-04 进行了正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）成像。对 120 名患有炎症性关节疾病的患者（包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎、中轴型脊柱关节炎以及无关节炎的对照组）进行了 FAP-PET/CT 扫描。在关节炎患者的滑膜和肌腱附着点处观察到了间充质细胞活化，表现为局部 FAP 示踪剂聚集，而非关节炎对照组则未见此现象。示踪剂聚集出现在上肢、下肢和脊柱的关节及肌腱附着点。间充质细胞的激活与炎症迹象相符，这是通过同时进行的磁共振成像（MRI）测量得出的，并且与相应疾病中经过验证的临床疾病活动综合评分相关。为了测试 FAP 信号是否与与结构损伤相关的成纤维细胞反应有关，进一步根据 MRI 和 CT上是否存在侵蚀和/或骨增生性改变对区域进行分层。在没有结构变化的炎症部位，FAP 示踪剂摄取量低或缺失，而在有侵蚀和骨增生性改变的病变中摄取量高。随访扫描显示，在细胞因子阻断后，FAP 信号显著减少，甚至完全消失。在性别和年龄匹配的对比分析中，IL-17i 治疗后 FAP 信号的降低幅度显著大于 TNFi 治疗。这些数据表明，在炎症消退期间，间质细胞的活化是可逆的，提示常驻成纤维细胞可能改变其功能模式，并可能获得更具消炎作用的表型。
 

Fig 1. 关节炎患者体内的 FAP 示踪剂摄取情况

2. 促炎细胞因子诱导关节中成纤维细胞活化和FAP摄取
为了在功能上测试关键炎性细胞因子对关节中间充质活化的作用，在临床前关节炎模型中进行了FAP-PET，组织学分析与炎症和损伤有关的变化。未处理小鼠在关节中未显示FAP示踪剂摄取，并且具有保留的关节结构。FAP示踪剂的摄取与相应踝关节的炎症和损伤程度相关。与骨增生性病变相比，侵蚀性病变中FAP示踪剂的摄取没有差异。TNF和IL-17 α的阻断显著降低了关节中的FAP示踪剂摄取，同样，IL-17 i的效果比TNFi治疗更显著这些数据表明人类和实验性关节炎的消退与炎症消退过程中间充质活化的变化有关。

3. 炎症消退期间成纤维细胞的分子转变
整合了33个scRNA-seq数据集得到总共52，131个来自关节的间充质细胞，并进行了无偏聚类。与以前的报道一致，综合数据集证实了关节间充质细胞的高度异质性。无监督聚类显示了七种不同的间充质细胞类型。滑液衬里和下层衬里亚型之间存在明显的分离。此外，各自的特征基因与所描述的下层衬里Mmp 3+相关，I16+、Pi 16+成纤维细胞亚型，并且还在数据集中稳健地鉴定了软骨细胞和成骨细胞。除了成纤维细胞区室内的总体中度变化外，在细胞因子抑制后，检测到先前未探索的CD200+成纤维细胞群体的显著增加。CD200+成纤维细胞表达高水平的Cdh 11、Dkk 3，但不表达Lrrc 15。虽然TNF抑制仅轻微增加CD200+成纤维细胞，IL-17 a抑制诱导显著的上调。为了排除离散聚类引入的潜在偏差及其对细胞亚型丰度的影响，作者还实施了MELD算法，MELD证实，IL-17 i处理后，CD200+成纤维细胞增加。此外，使用CellRank显示，在IL-17 i刺激后，所有亚组的亚衬成纤维细胞中向CD200+成纤维细胞分化的可能性普遍增加。因此，CD200+成纤维细胞在关节炎消退的时间过程中持续增加，并最终在完全缓解结束时减少。
 

Fig 2. Cd200+成纤维细胞是一种新的成纤维细胞亚型，在炎症消退过程中出现

4. CD200+成纤维细胞维持促消退ILC的2型的命运和存活
接下来研究了促分解的CD200+成纤维细胞的功能特性，对所选通路的单样本基因集富集分析显示，与Mmp 3+和Il 6+成纤维细胞或成骨细胞相比，CD200+成纤维细胞具有较强的抑制炎症通路的能。其活化受体CD200R1在ILC 2上显示出最高表达，这与关节炎的消退有关。因此，细胞间相互作用分析揭示了在组织稳态期间CD200+成纤维细胞和ILC 2之间的稳健通信概率，其在关节炎期间丢失。为了进一步阐明CD200影响ILC 2的机制，在该模块中共表达的基因的功能富集分析表明，CD200R1激活后存在促存活信号因此，CD200R1刺激导致体外ILC 2细胞凋亡的显著减少。此外，CD200R1和Gata 3的共表达表明CD200R1信号传导在维持ILC 2表型中的潜在作用。通过计算敲除ILC上的CD200R1来研究这种潜在作用。为了验证这一概念，用重组CD 200-FC治疗患有诱导性关节炎的小鼠。这种治疗显著减轻了关节的炎症反应以及 FAP 示踪剂的摄取量，并且还显著减少了关节损伤。
 

Fig 3. Cd200+成纤维细胞维持促消退ILC的2型命运和存活

5. 小鼠和人中促消退CD200+ DKK 3+的保守表型
作者探究了这种与 CD200+ 成纤维细胞相关的促消退网络是否也存在于人类关节炎中。在疾病缓解期间，人类关节中的 FAP 示踪剂摄取显著减少甚至完全消失。类风湿关节炎（RA）和银屑病关节炎（PsA）患者滑膜活检样本中的 CD200 表达与疾病严重程度评分 DAS28 呈负相关。通过整合四个公开可用的数据集，创建了人类 RA 和 PsA 滑膜单细胞的综合图谱，并确定了主要的细胞异质。接下来，进行了进一步的整合步骤，将小鼠 Il23mc 处理的 hTNFtg 成纤维细胞映射到人类对应细胞，从而在人类中识别出与在图谱上观察到的相同方式形成不同转录邻域的同源成纤维细胞亚型，同时其marker表达也相似。为了探究每种成纤维细胞亚型在组织中的空间分布情况，并量化其与不同免疫细胞的共定位情况，随后对RA和PsA患者的滑膜活检样本进行了空间转录组学分析。以高分辨率识别组织中的空间异质性簇，这些簇对应于滑膜组织的致病性和解剖区域。对与不同细胞类型相对应的基因模块进行评分，然后对这些评分在空间簇之间进行层次聚类，揭示了在无明显炎症的区域中，CD200+/DKK3+ 成纤维细胞与诸如 ILC2s 和嗜酸性粒细胞等促消退免疫细胞的共存情况。相比之下，MMP3+ /IL6+ 成纤维细胞与促炎性免疫细胞在具有活跃炎症表型的区域共定位。此外，对先前在小鼠成纤维细胞亚型中介绍的通路的评分证实，在 MMP3+ /IL6+ 集群所在的区域存在炎症特征，在 CD200+ /DKK3+ 所在的区域则存在抗炎特征，这表明成纤维细胞对炎症微环境的调控具有位置特异性。最后，使用成像质谱分析（IMC）来分离 RA 和 PsA 患者滑膜中的 CD200+ 成纤维细胞。与空间转录组分析和小鼠数据一致，观察到在关节炎缓解的 RA 和 PsA 患者的滑膜中，CD200+ 成纤维细胞的比例显著增加。
 

Fig 4. 空间转录组学和成像质谱技术鉴定RA和PsA患者滑膜活检组织中的C200 + /DKK 3+成纤维细胞

参考文献：
Andreas Ramming, Simon Rauber, Hashem Mohammadian et al. Molecular reframing of fibroblasts during resolution of arthritis, 21 March 2023, PREPRINT (Version 1) available at Research Square [https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-2668533/v1]