WGBS+RNA-seq助力揭示植物不定根再生的DNA甲基化调控机制
2025-07-24 来源:本站 点击次数:131植物由于不能移动，会受诸如风、雪和动物等逆境胁迫，这些胁迫可能会破坏植物结构，因此再生能力对于植物生存至关重要。近日，北京林业大学生物科学与技术学院李云教授团队探索了植物刺槐（Robinia pseudoacacia L.）的不定根（Adventitious Roots, ARs）再生过程中DNA低甲基化（Hypomethylation）对基因调控网络的作用。研究通过使用DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷（5-azacytidine, 5-azaC）处理刺槐下胚轴切段，通过全基因组重亚硫酸盐测序（Whole-Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）和转录组测序（RNA-seq）技术，揭示了低甲基化激活以RpMYB2为中心的基因网络，进而显著增强不定根再生能力。相关研究成果以《DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots》为题发表于《Plant Cell Environ》期刊。
标题：DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots（DNA低甲基化激活以RpMYB2为中心的基因网络，以增强不定根再生）
发表时间：2025年2月
发表期刊：Plant Cell Environ
影响因子：IF6.3/Q1
技术平台：WGBS、RNA-seq
作者单位：北京林业大学李云等
DOI：10.1111/pce.15236
本研究利用5-azaC DNA甲基化抑制剂，使根原基的启动和发育更早发生，从而提高刺槐的不定根再生率。WGBS揭示了在5-azaC处理样本中，整体甲基化水平下降，而在所有背景（包括CHH、CHG和mergedCG）中，低甲基化胞嘧啶位点和区域增加，从而导致转录变异。酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）实验揭示了一个以RpMYB2为中心的转录因子（Transcription Factors, TFs）网络，这些转录因子被RpWRKY23、RpGATA23、RpSPL16以及其他基因如RpSDP、RpSS1、RpBEN1、RpGULL05和RpCUV转录激活，其核定位表明它们可能共定位。酵母单杂交（Yeast One-Hybrid, Y1H）实验揭示RpMYB2互作蛋白RpGATA23、RpWRKY23与RpSK6、RpCDC48的启动子互作，而荧光素酶报告基因实验（Luciferase Reporting Assay, LRA）验证了其与RpSK6结合。本研究结果表明，低甲基化介导的转录组修饰激活了以RpMYB2为中心的基因网络，从而增强了刺槐下胚轴切段的不定根再生能力。这些发现为通过遗传改良提高植物再生能力和增加木材产量，同时抵御环境损害提供了理论基础。
研究方法
- 植物材料收集与再生：使用刺槐种子萌发后的下胚轴切段作为实验材料，分别在含和不含5-azaC的培养基上培养，观察不定根再生情况。
- 石蜡切片与解剖分析：对处理和未处理的切段进行石蜡切片，观察不定根原基的启动和发育过程。
- WGBS分析：分析全基因组范围内的DNA甲基化水平。
- RNA-seq分析：分析基因表达差异。
- 实时定量PCR（qRT-PCR）验证：对RNA-seq结果中差异表达的基因进行验证。
- 酵母双杂交（Y2H）和酵母单杂交（Y1H）实验：鉴定与RpMYB2互作蛋白，以及这些蛋白与下游基因启动子的结合情况。
- 荧光素酶报告基因实验（LRA）：验证特定转录因子与目标基因启动子的结合。
- 亚细胞定位分析：通过共聚焦显微镜观察关键蛋白在细胞中的定位。
结果图形
（1）不定根原基的启动与发育
研究通过石蜡切片观察了5-azaC处理和未处理切段的不定根原基启动和发育过程。从8日龄幼苗的下胚轴切取1cm长的切段作为外植体，并在切割后的五个时间点（包括切割后的第0天、第1天、第2天、第3天和第4天，分别标记为D0、D1、D2、D3和D4）进行横截面分析。通过在不同时间点的组织学对比区分对照组（D1C、D2C、D3C、D4C）和5-azaC处理组（D1T、D2T、D3T、D4T）外植体中原基的发育进程以及根分生组织的增殖情况。结果显示，5-azaC处理显著加速了不定根原基的启动和发育，处理组在第4天即可观察到不定根的形成，而对照组则未能发育出完整的不定根（图1）。这表明5-azaC通过促进细胞分裂和分化，显著增强了不定根的再生能力。
图1：不定根形成及横切切段的解剖学研究。
(a) 1cm长的下胚轴切段放置在含和不含5-azaC培养基上的形态学特征。(b) 每段不定根数量。
(c) 下胚轴切段的解剖结构显示了不定根原基的启动和发育。与对照组相比，处理组（D2T）的不定根原基启动更早。在（D3T）中形成了根冠，而在（D4T）中原基发展为功能性不定根，但在（D3C，D4C）中，根分生组织未能发育。
（2）全基因组甲基化图谱与不定根再生能力
通过WGBS分析，研究发现5-azaC处理显著降低了基因组整体甲基化水平，尤其是在CHH、CHG和mergedCG三种序列背景下。在基因组的不同区域（包括启动子、基因体和终止子下游区域），处理组的甲基化水平均显著低于对照组，尤其是在CHH背景下，甲基化水平降低更为显著（图2a-c）。这表明低甲基化可能通过影响基因表达调控来增强不定根的再生能力。
图2：5-azaC处理介导全基因组低甲基化。
在5-azaC处理和对照样本中，第2天和第4天的基因及其±2kb区域CHH背景（a）、CHG背景（b）和mergedCG背景（c）中的DNA甲基化水平变化。在CHH背景（d）、CGH背景（e）和mergedCG背景（f）中，不同基因组元件（包括启动子、外显子、5′UTR和3′UTR）中高甲基化和低甲基化差异甲基化位点（DMCs）数量。在CHH背景（g）、CGH背景（h）和mergedCG背景（i）中，不同基因组元件（包括启动子、外显子、5′UTR和3′UTR）中高甲基化和低甲基化差异甲基化区域（DMRs）数量。（3）低甲基化位点和区域激活与不定根再生相关的基因
研究通过分析差异甲基化位点（DMCs）和差异甲基化区域（DMRs），发现5-azaC处理显著增加了基因调控区域的低甲基化位点和区域数量。特别是在启动子区域，低甲基化的DMCs和DMRs数量显著多于高甲基化的情况（图2d-i）。这些低甲基化位点和区域与不定根再生相关的基因表达激活密切相关，如RpMYB2、RpWRKY23等基因在低甲基化后表达显著上调。
（4）转录组分析鉴定5-azaC处理激活的基因及低甲基化RpMYB2的潜在互作因子
RNA-seq分析显示，5-azaC处理显著改变了基因表达谱，特别是在处理4天后，差异表达基因数量显著增加。这些差异表达基因主要包括细胞分裂、细胞分化、激素信号转导等生物学过程（图3）。其中，低甲基化激活的基因如RpMYB2、RpWRKY23等在不定根再生中发挥关键作用，且这些基因可能通过与其他基因互作来调控不定根再生。
图3：DNA低甲基化导致转录组变化，从而引起基因差异表达。
火山图展示了D2C与D2T组（a）以及D4C与D4T组（b）之间的差异表达基因（DEGs）。热图描绘了D2C与D2T组（c）以及D4C与D4T组（d）之间的差异表达基因。所选上调和下调差异表达基因的相对表达量（e）。（5）酵母双杂交实验揭示低甲基化RpMYB2在增强生根能力的基因互作网络中的中心地位
酵母双杂交实验结果表明，低甲基化激活的RpMYB2是基因互作网络的中心节点，与多个转录因子和功能蛋白相互作用，如RpGATA23、RpWRKY23、RpSDP等（图4）。这些相互作用蛋白在不定根再生过程中发挥协同作用，调控细胞分裂、细胞分化和激素信号转导等过程。
图4：通过酵母双杂交实验检测蛋白-蛋白互作。展示RpMYB2和RpSDP蛋白与其他蛋白的正向互作。
（6）酵母单杂交实验揭示以RpMYB2为中心的基因网络的进一步见解）
酵母单杂交实验进一步验证了RpMYB2互作蛋白与下游基因启动子的结合情况。实验发现，RpWRKY23和RpGATA23能够与RpSK6和RpCDC48的启动子结合，表明这些转录因子通过调控下游基因的表达来增强不定根的再生能力（图5A）。
图5：通过酵母单杂交和荧光素酶报告基因实验分析DNA-蛋白互作。
- 酵母单杂交（Y1H）展示了不同转录因子与RpSK6和RpCDC48启动子之间的相互作用。
- 荧光素酶报告基因实验显示转录因子RpWRKY23和RpGATA23与RpSK6启动子的相互作用。
荧光素酶报告基因实验结果进一步证实了酵母单杂交实验的发现，即RpWRKY23和RpGATA23能够与RpSK6的启动子结合并激活其表达（图5B）。这表明这些转录因子在不定根再生过程中通过调控关键基因的表达发挥重要作用。
（8）亚细胞定位分析揭示以RpMYB2为中心的互作网络中蛋白的亚细胞定位
亚细胞定位分析显示，RpMYB2及其互作蛋白主要定位于细胞核，部分蛋白如RpSDP和RpWRKY23还定位于细胞质膜（图6）。这表明这些蛋白在细胞核内与其他基因相互作用，调控基因表达，同时也可能参与细胞质膜相关的生物学过程。
图6：RpMYB2互作蛋白的亚细胞定位。共聚焦激光扫描显微镜图像显示了用GFP标记的蛋白的细胞内分布。所有研究的蛋白主要定位于细胞核。RpMYB2、RpSDP和RpWRKY23还显示出在质膜定位。
结论和启示
本研究通过WGBS和RNA-seq技术揭示了DNA低甲基化在刺槐不定根再生中的调控作用。研究发现，5-azaC处理通过降低基因组整体甲基化水平，激活了以RpMYB2为中心的基因网络，显著增强了不定根的再生能力。这一发现不仅为理解植物再生的分子机制提供了新的视角，还为通过遗传改良提高植物再生能力和适应环境胁迫提供了潜在的靶点。
WGBS和RNA-seq技术在解析植物表观遗传调控中的重要作用
WGBS和RNA-Seq的联合应用，研究者能够从表观遗传修饰和基因表达两个层面，全面解析DNA低甲基化在不定根再生中的调控机制。通过整合分析，研究者发现低甲基化位点和区域的变化直接导致了相关基因表达的激活，从而促进了不定根的再生。这种协同分析不仅揭示了DNA甲基化对基因表达的调控作用，还为理解植物再生过程中的表观遗传调控机制提供了新的视角。
关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
应用方向：
WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）
- 全基因组甲基化图谱课题
- 标志物筛选课题
- 小规模研究课题
- 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
- 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
- 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。
Hussain SS, Li Y, Liu J, Abbas M, Li Q, Deng H, Abbas S, Han K, Han J, Sun Y, Li Y. DNA Hypomethylation Activates the RpMYB2-Centred Gene Network to Enhance Regeneration of Adventitious Roots. Plant Cell Environ. 2024 Oct 28. doi: 10.1111/pce.15236.
相关文章
更多 >