赛业生物在传统ES打靶技术的基础上，研发出了升级版的TurboKnockout^®基因编辑技术，利用优化的纯合ES克隆打靶体系，可筛选基因敲除、敲入、点突变的纯合ES细胞。该技术结合了囊胚前注射和四倍体补偿技术进行显微注射，确保产生的Founder小鼠达到100%嵌合状态，所有组织细胞均完全由外源ES细胞分化发育而来，解决了传统技术中嵌合体比例不稳定的问题。基因编辑周期快至3个月，可大批量获得基因一致的纯合子小鼠。
 

TurboKnockout^®技术 100%嵌合率的验证数据

该项技术的稳定性经过一系列实验得到了验证，流程为：载体构建→ES打靶→PCR/FACS验证→阳性胚胎制作→“100%”嵌合F0胚胎及小鼠生产→嵌合率验证。

首先我们构建了Rosa26安全位点过表达载体CAG>Luciferase>EGFP质粒，在C57BL/6N WT ES细胞上获得了PCR正确的阳性克隆，之后通过流式验证EGFP正确表达。
 

载体构建、ES克隆筛选及EGFP表达检测

我们将上面获得的阳性ES克隆通过显微注射获得阳性Founder小鼠，继而通过常规传代获得纯合F2代雄鼠。把F2雄鼠和C57BL/6N WT雌鼠配繁产生可用于TurboKnockout^®技术显微注射的阳性受体胚胎，通过在该背景胚胎显微注射C57BL/6N WT的ES细胞和未注射ES细胞的空扎受体胚胎，分别产生12.5d胚胎及4周龄的Founder小鼠，验证Founder小鼠Luciferase和EGFP的表达情况。

结果显示，12.5d的空扎胚胎（图2.A）相对于注射了C57BL/6N WT ES细胞的胚胎（图2.B）有明显的EGFP表达，将胚胎通过胰酶和DNA酶解离为单细胞后，经流式细胞仪检测，空扎胚胎相对注射了C57BL/6N WT ES细胞的胚胎EGFP也是全部表达的，且注射了C57BL/6N WT ES细胞的胚胎未检测到EGFP阳性细胞泄露表达。

12.5d胚胎EGFP荧光拍照及流式检测

空扎胚胎和注射了WT ES细胞的胚胎分别移植ICR代孕鼠出生的Founder鼠到4周龄后，分别对2种小鼠做了活体成像，结果显示注射了C57BL/6N WT ES细胞的胚胎未见Luciferase荧光泄露表达（图3.B），同时空扎的胚胎发育而来的小鼠表现为Luciferase强荧光（图3.A），且差异极显著（图3.C P=0.0074）。

4周龄Founder鼠活体成像结果

为进一步验证注射了C57BL/6N WT ES细胞的胚胎是否有CAG>Luciferase>EGFP细胞嵌合，分别对注射了WT ES细胞的4周龄小鼠取材心、肝、脾、肺、肾和12.5d胚胎组织进行PCR验证，同时添加空扎胚胎做为阳性对照，结果注射了C57BL/6N WT ES细胞的F0小鼠各组织和胚胎均未检测到MT条带。

4周龄Founder鼠和12.5d胚胎PCR鉴定

（1-5：注射WT ES 1鼠的心、肝、脾、肺、肾；6-10：注射WT ES 2鼠的心、肝、脾、肺、肾；11-15：注射WT ES 3鼠的心、肝、脾、肺、肾；16-21：注射WT ES 12.5d胚胎组织；22-25：12.5d的空扎胚胎组织；26：WT对照；图中加了700bp内参）

总结：TurboKnockout^®技术生产的Founder小鼠为100%嵌合状态，所有Founder小鼠的组织细胞均由外源ES细胞分化发育而来。

TurboKnockout^®基因编辑技术优势

1.编辑类型多样化：可进行基因敲除、敲入、点突变或人源化等多种项目类型的基因修饰；
2.QC体系多样化：细胞阶段除了可进行除常规PCR鉴定外，还可以通过多种手段质检（QC）ES克隆打靶的准确性，包括染色体核型鉴定、Southern Blot鉴定、qPCR鉴定、FACS鉴定等表达检测；
3.F0基因型稳定：结合赛业生物专利：TurboKnock显微注射技术和四倍体补偿技术，保障交付的所有F0代小鼠的基因型一致，基因修饰准确、效果稳定；
4.品系选择灵活：赛业生物可提供C57BL/6NCya、C57BL/6JCya、BALB/cAnCya、129S2/SvPasCya等多品系选择。

TurboKnockout^®基因编辑小鼠模型

HUGO-GT^®全基因组人源化模型列表（精选）

2.HUGO-Ab^®全人源抗体小鼠
基于创新性全人抗体药物研发的需求，赛业生物凭借扎实的技术创新实力以及自主研发的TurboKnockout^® ES打靶技术，构建了下一代HUGO-Ab^®全人源抗体小鼠，携带了全套人类免疫球蛋白基因，能够在体内产生具有高亲和力和低免疫原性的全人源抗体。系列产品包含HUGO-Mab™全人单克隆抗体小鼠、HUGO-Light™全人共轻链抗体小鼠和HUGO-Nano™全人纳米抗体小鼠，拥有丰富的抗体序列多样性，包含全部的人源抗体重链、Kappa和Lambda轻链可变区germline基因，其卓越的性能在抗体发现过程中展现出良好的效果，得到多家跨国药企、生物制药公司和学术机构的认可，为治疗性抗体新药提供了高效的研发引擎。

此外，赛业生物还提供多种基因编辑定制服务，包括完全性基因敲除小鼠、条件性基因敲除小鼠、基因敲入小鼠以及利用KO-First技术灵活构建完全性或条件性敲除小鼠，以满足不同研究需求，为药物筛选、信号通路分析和遗传机制解析提供高效工具。