近日，中国科学院武汉植物园万涛和王青锋研究员团队在百岁兰（Welwitschia mirabilis）叶片衰老的调控机制研究方面取得了新进展。相关研究成果已经发表在国际权威期刊《Plant Biotechnology Journal》（IF=10.5、一区top期刊）上。

百岁兰是一种古老的裸子植物，以其仅有的两片叶片可存活千年而闻名，且能适应极端干旱的纳米布沙漠环境。目前，针对其叶片抗旱机制的研究已有较多积累，但关于叶片衰老的内在调控机理，人们仍所知甚少。尽管针对其叶片抗旱机制的研究较多，但对叶片衰老的内在调控机理所知甚少。不同于典型植物叶片从尖端向基部衰老的模式，百岁兰的衰老局限于叶尖（S6区域），其余部分保持绿色，暗示独特的程序化衰老途径。生理分析显示，衰老区域（S6）的脱落酸（ABA）含量显著升高，电解质渗漏率增加，叶绿素含量下降。分子层面，ABA生物合成关键基因（WmNCED6、WmNCED9）、衰老相关基因（WmSEN1、WmSEN2）及叶绿素降解基因（WmPAO1-1、WmPAO2-1）在S6区表达上调，表明ABA积累是驱动衰老的核心因素。

先前研究提出，叶片持续生长由KNOX-PHAN基因模块调控，但衰老的转录调控网络仍不明确。ABA作为叶片衰老的核心激素，其合成与信号通路在百岁兰中尚未深入探索。该研究通过筛选衰老诱导的启动子顺式元件，发现MYB结合位点（MBS）高频率出现在ABA合成基因（WmNCEDs）的启动子中，进而锁定R2R3-MYB转录因子WmMYB111。该基因表达受ABA诱导且与衰老进程同步，暗示其核心调控作用。进一步研究表明，ABA信号通路的关键因子WmABF1-1（ABF家族成员）能直接激活WmMYB111，形成WmABF1-1-WmMYB111调控模块，通过级联放大ABA信号并整合叶绿素降解与氮（N）转运过程（图1）。

此外，叶片衰老过程伴随氮的再分配，衰老区域的氮含量显著降低而氮转运基因（WmNRT1.7a、WmNRT2.5）被激活。低氮条件加速衰老，高氮则延缓，证实衰老与营养回收的紧密关联。WmABF1-1与WmMYB111能直接激活WmNRTs启动子，表明该模块通过协调ABA积累、叶绿素降解和氮转运，实现衰老过程的资源优化利用。

图2 . ABA合成基因WmNCED6和WmNCED9对叶片衰老的调控作用

为了验证百岁兰ABA合成基因WmNCED6和WmNCED9是否具有驱动衰老的功能。研究者通过在拟南芥（Col-0野生型背景）中过表达这两个基因（获得转基因株系WmNCED6-OE#1,2与WmNCED9-OE#1,2），检测第三、第四莲座叶的衰老表型，并利用广州博鹭腾生物科技有限公司PlantView230F调制叶绿素荧光活体成像系统检测光合效率（Fv/Fm）（图2）。结果显示：与野生型相比，所有过表达株系叶片均表现显著加速衰老——叶片大面积黄化萎蔫（视觉表型），同时其Fv/Fm比值（光合作用核心指标）急剧下降，平均值从野生型的0.78 ± 0.02降至0.53 ± 0.03（p < 0.01），表明叶绿素降解导致光合功能严重受损。

图3 . 转录因子WmMYB111对叶片衰老的调控作用
 

图4 . ABA信号因子WmABF1-1和转录因子WmMYB111对叶片衰老的调控作用

类似地，为验证百岁兰转录因子WmMYB111对衰老的调控作用，通过分析拟南芥野生型（Col-0）与过表达株系（WmMYB111-OE#1,2）第三、第四莲座叶的衰老表型及Fv/Fm比值（图3）。结果显示：过表达WmMYB111的转基因植株叶片显著延缓衰老——相较于野生型叶片明显黄化萎蔫，转基因株系叶片维持绿色状态更久，且其光合功能关键指标Fv/Fm比值显著高于对照组（数据基于多个生物学重复）。

为验证 WmABF1-1在百岁兰叶片衰老中的功能，采用TRV介导的基因沉默技术构建 WmABF1-1 敲低株系（TRV-WmABF1-1）与空载体对照（TRV-control），观测离体叶盘在20天内的衰老进程（图4）。结果显示：沉默WmABF1-1显著延缓衰老——TRV-control叶盘在第15天明显黄化萎蔫（黄化面积＞80%），而TRV-WmABF1-1叶盘至第20天仍保持＞60%绿色面积；同步进行的叶绿素荧光效率（Fv/Fm）测定进一步证实，TRV-control的Fv/Fm值从初始0.82±0.03持续降至第20天0.35±0.05（降幅57.3%），而沉默组同期仅降至0.68±0.04（降幅17.1%，P < 0.001）。该结果直接证明 WmABF1-1通过促进叶绿素降解与细胞解体程序正向调控衰老。

在ABA缺陷突变体aba1-5的衰老叶段中，通过瞬时表达ABA信号因子WmABF1-1和衰老抑制因子WmMYB111，分析第10天局部区域表型、光合效率（Fv/Fm）（图4）。结果表明：WmMYB111过表达能显著延缓衰老——处理区域叶片的黄化程度明显减轻，其Fv/Fm值显著高于对照组（达基部水平），直接证实WmMYB111具有抑制衰老程序执行的功能；而WmABF1-1过表达则加速衰老，导致Fv/Fm值下降，叶片萎蔫加剧。
 

图5. 烟草叶片双荧光素酶实验

另外，为明确WmMYB111转录因子对其靶基因启动子的激活能力，WmABF1-1对百岁兰衰老核心基因的调控功能，以及WmABF1-1与WmMYB111对百岁兰氮转运基因（WmNRT1.7a与WmNRT2.5）的调控机制。在本氏烟草叶片中进行双荧光素酶实验（图5）。利用广州博鹭腾生物科技有限公司PlantView植物活体成像系统检测发现：WmMYB111显著增强所有其靶基因启动子的活性；WmABF1-1对三类启动子均具有显著激活作用；WmMYB111显著激活所有氮转运基因启动子片段活性，WmABF1-1则强烈抑制氮转运基因上述启动子。

以上结果证明过表达WmNCED6/9可通过促进ABA合成，在模式植物中直接触发早衰，不仅验证了二者在百岁兰叶尖衰老中的核心作用，也为"ABA积累→衰老执行"通路提供了跨物种功能证据。

WmMYB111作为衰老负调控因子，能够有效抑制叶绿素降解并维持光合机构完整性，从而延迟衰老进程，同时也揭示其作为ABA通路下游的核心衰老负调控因子，通过独立于ABA的方式维持光合功能与营养滞留。

论文链接：
https://doi.org/10.1111/pbi.70290