CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是细菌和古菌所使用的一种适应性免疫系统，其通过记录和靶向病毒的 DNA 序列来抵御入侵的病毒。这一机制已被重新改造为一种简单、可靠且用途广泛的技术，用于哺乳动物及其他生物的基因组编辑，使研究人员能够对各类生物学过程和疾病状态进行研究。

CRISPR筛选是功能基因组学研究人员不可或缺的工具，但传统筛选方法既复杂又耗时，而且数据输出的分辨率低。传统筛选实验使用Bulk RNA 输入来评估所有细胞的平均基因表达水平，从而掩盖了细胞异质性；与之不同的是，单细胞 CRISPR 筛选技术能在单细胞水平上，评估整个转录组中多个基因以及每个单独 sgRNA 的扰动效应。（图1）

图1

如果说传统CRISPR是一把分子剪刀，那么单细胞CRISPR可谓是一把多功能的瑞士军刀，可快准狠的破解生物的多重奥秘。

来自单细胞分析引领品牌10x Genomics的Chromium单细胞CRISPR筛选技术带来了一个更简单、更快速的工作流程，采用Feature Barcode技术和新一代测序技术来检测单链向导RNA（sgRNA），该技术可评估慢病毒向导 RNA（sgRNA）转导的单细胞输入，提供了一种高通量、可扩展的方法，能在同一个单细胞中同时获取基因表达谱和 CRISPR 介导的扰动表型。（图2）

图2  * 包括扰动或施加刺激后的培养时间

10x Genomics最新版GEM-X试剂提供了两种单细胞CRISPR筛选实验方案：应用于新鲜样本的GEM-X 5’ CRISPR Screening，以及应用于固定后样本的GEM-X Flex CRISPR Screening。这两款产品均能将单细胞基因表达分析与CRISPR筛选相结合，以单细胞分辨率将CRISPR扰动与完整的基因表达表型直接关联。

GEM-X 5’ CRISPR Screening

采用 Feature Barcode 技术进行 CRISPR 筛选的 Chromium 单细胞免疫组库分析（也称为单细胞 5' 端 CRISPR 筛选）提供了一种多组学研究方法，可从同一个单细胞中同时检测基因表达、CRISPR 向导分子、细胞表面蛋白和 / 或免疫细胞克隆型频率。这种单细胞 5' 端 CRISPR 筛选方法与大多数 Cas9 CRISPR 载体兼容，且无需在向导 RNA（sgRNA）中整合特定捕获序列。

10x Genomics建议每个靶向向导 RNA（sgRNA）使用100-200个细胞，这能确保有足够的统计检验力来判断扰动的显著性。对于非靶向向导 RNA（sgRNA），其对于提供计算扰动所需的基线至关重要，建议使用 5-10% 的非靶向sgRNA。Chromium 单细胞 CRISPR 筛选检测试剂盒Chromium GEM-X 5’ 芯片的每个通道上可回收多至 20,000个细胞，其中1,000-2,000个（5%-10%）细胞为含非靶向向导 RNA（sgRNA）的细胞。每个靶向向导 RNA（sgRNA）应对应 100-200 个细胞。采用这种设置，使用GEM-X 5’ 芯片的单个通道即可检测约 90-180 个向导 RNA（sgRNA）。如果您希望检测更多种sgRNA，可加大细胞量，上满芯片所有8个通道且回收160,000 个细胞，便可进行Pooled CRISPR筛选，检测约1000个sgRNA。

【实验流程】

1. 确认sgRNA兼容性

为兼容 Chromium 单细胞 5' 端 CRISPR 筛选检测试剂盒，向导 RNA（sgRNA）需经工程改造以适配标准 Cas9 系统，图3 显示了5’ CRISPR 反转录引物的结合区域。

图3

CRISPR 逆转录（RT）引物设计于向导 RNA（sgRNA）骨架的高度保守区域，以实现对各类Cas9系统的高兼容性。该序列（5’-CAAGTTGATAACGGACTAGCC-3’）与向导 RNA 骨架序列互补。在进行单细胞CRISPR实验前，建议将CRISPR 引物序列的反向互补序列，与目标 sgRNA 向导文库进行 BLAST 比对，以确认兼容性。上述引物序列的反向互补序列为：5'-GGCTAGTCCGTTATCAACTTG-3'。若向导 RNA 骨架不含上述序列，可设计定制化富集引物来扩增特殊向导 RNA。

2.sgRNA捕获及文库构建

将带有条形码的单细胞 5'凝胶珠、含有转导细胞的 Master Mix（混合反应液）以油（Partitioning Oil）GEM-X 5’ 芯片上混合，即可生成 GEMs（油包水微滴）。GEMs 生成后，凝胶珠立即溶解，油包水内细胞随之裂解。凝胶珠释放出寡核苷酸，与细胞裂解物以及含有逆转录（RT）试剂和引物混合物的 Master Mix 混合。通过孵育 GEMs，可同时从细胞mRNA 中生成带有 10x 条形码的全长 cDNA，并从 sgRNA中生成带有条形码的 DNA，进而可从这些带有 10x 条形码的 cDNA 中构建出可用于测序的基因表达文库和 CRISPR 筛选文库（图4）。

图4

3.文库测序及数据分析

在确定特定扰动的效应时，目标基因表达的动态测序深度范围是关键因素。由于特定基因的 UM数量取决于基因表达文库的整体测序深度，文库的测序深度越深，可检测到的 UMI 就越多（直至基因表达文库达到饱和状态，此时每增加一次新的测序读数，检测到新 UMI 的可能性极低）。特定基因检测到的 UMI 数量越多，其表达变化被检测到且具有显著性的可能性就越大。下图（图5）建议了5’表达谱、5’ CRISPR等文库的最低测序量。

图5

使用10x Genomics数据分析软件Cell Ranger 9.0.0版本分析每个反应通道的数据，如实验中大量细胞上样到多个反应通道，可使用cellranger aggr流程将生成的多个输出结果汇总在一起。

GEM-X Flex CRISPR Screening

10x Genomics Chromium GEM-X Flex基因表达分析技术为固定样本中的基因表达检测提供了全面且可扩展的解决方案。在该检测中，10x Genomics公司提供了预先设计的人和小鼠的全转录组探针panel，用于目标基因杂交。您可根据本文件中的指导设计定制化探针，添加到商品化的探针试剂盒中，用于在检测基因表达的同时检测CRISPR 筛选。

1. CRISPR Guide Probe设计合成及使用说明

用于 GEM-X Flex 基因表达分析的 CRISPR 向导探针设计请见图6概述，探针设计的序列详见表1，所使用的 CRISPR LHS 探针 barcode 序列（CR001-CR016）列于表 2 中。

图6

表1

要设计用于GEM-X Flex检测的CRISPR向导捕获定制探针，必须预先知晓向导骨架（guide scaffold）和间隔序列（spacer sequences），探针设计参考以下原则：
 · 左侧探针（LHS Probe）包含TruSeq R2、探针条形码（Probe Barcode）以及一段25 bp的向导骨架互补序列。TruSeq 接头可添加CRISPR文库的Index。
· CRISPR左侧探针条形码（LHS Probe Barcode）序列与全转录组分析（WTA）探针中使用的序列不同，详见表 2。
· 右侧探针（RHS Probe）包含 5’磷酸基团（/5Phos/）、一段 5 bp 的向导骨架互补序列、一段20 bp的靶向间隔序列互补序列，以及部分Capture Sequence 1（pCS1）。

表2

在多样本混样实验中，每个左侧探针（LHS Probe）必须带有唯一的 8 碱基探针条形码（CR001-CR016；序列详见表 2），且每个杂交反应的 CRISPR 探针和全转录组扩增（WTA）探针均需使用唯一的探针条形码对，即同一 CRISPR 探针条形码不得与多个 WTA 探针条形码搭配使用。在单重实验中，可省略该探针条形码。

定制探针可从任何寡核苷酸合成供应商处订购。10x Genomics已在IDT提供的多种形式定制探针中进行了测试，包括DNA寡核苷酸（标准脱盐）、Ultramer DNA 寡核苷酸和 oPool 寡核苷酸库。在有限的测试中，所有形式均观察到了可比较的结果。

合成探针关键指导原则如下：
· 探针应经过标准脱盐处理。
· 无需进行 HPLC 纯化。
· 探针应重悬于 IDTE（或低 EDTA TE 缓冲液）中。
· 右侧（RHS）探针必须进行 5' 磷酸化。
· 带条形码的左侧（LHS）探针应单独订购，采用标准脱盐形式。
· 右侧（RHS）探针可单独以标准脱盐形式订购，也可作为 oPool 寡核苷酸库订购。

使用CRISPR Guide Probe，需首先制备一个混合的 spike-in 库，其中包含终浓度为 40 nM 的各右侧（RHS）探针，以及终浓度为400 nM的带条形码的CRISPR 左侧（LHS）探针。在向重悬的细胞沉淀中加入10x Genomics的人/小鼠全转录组扩增（WTA）探针后，再向样本中加入2.5 μl该spike-in库。

每个靶向sgRNA建议上样100–200个细胞，以确保有足够的统计效力来确定扰动的显著性。对于非靶向 sgRNA（其对提供计算扰动的基线至关重要），建议上样500–1000个细胞。当使用全部16种探针进行多重检测时，使用GEM-X Flex检测可从每个反应可回收多达320,000个细胞。当使用芯片的全部8个孔（目标回收率约为2.5×10⁶个细胞）时，可检测的sgRNA总数（包括非靶向 sgRNA）为12,000–25,000个。

2.实验流程及需要准备的额外试剂

GEM-X Flex基因表达和CRIPSR检测的实验流程如下图（图7）

图7

使用GEM-X Flex检测试剂盒进行CRISPR筛选时，除GEM-X Flex试剂盒外，还需要以下额外的10x Genomics试剂：
・Dual Index Kit TT Set A 96 rxns, PN-1000215
・Amp Mix，可从GEM-X Single Cell 5' Feature Barcode Kit （PN-1000703）中获取。
・用户自备的 TruSeq 引物，引物应订购标准脱盐级别的产品。

- 正向引物（TruSeq Read 1）：CTACACGACGCTCTTCCGATCT
- 反向引物（TruSeq Read 2）：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG

为进行 CRISPR 筛选，需要在原User Guide（CG000789）基础上对以下步骤进行修改或新增，具体操作请参考10x Technical Note CG000814：
Step 1: Probe Hybridization (Modified)
Step 4: Pre-Amplification PCR (Modified)
New Step: Feature PCR
New Step: CRISPR Screening Library Construction 

3.文库测序及数据分析

建议将GEM-X Flex CRISPR 筛选文库与基因表达文库混合二者混合，以在测序过程中维持核苷酸多样性。GEM-X Flex 基因表达文库的建议最低测序深度为 10,000 read Pairs / 细胞，GEM-X Flex CRISPR 筛选文库的建议最低测序深度为 5,000 read pairs / 细胞。图8和图9 分别展示了两文库结构及测序读长建议。

图8

图9

10x Genomics数据分析软件Cell Ranger支持对单重和多重 Flex+CRISPR 数据的分析。在分析多重实验时，Multi Config CSV 文件需要同时指定 WTA（全转录组扩增）和 CRISPR 的探针条形码，详情请参见 10x Genomics 支持网站（Flex Gene Expression & Feature Barcode Analysis with Cell Ranger multi (Singleplex & Multiplex) | 10x Genomics）。与目前市场上的 CRISPR 工作流程类似，需要使用特征参考文件（feature reference file）来识别不同的前间区序列邻近基序（protospacer）。请参照 “5' CRISPR 向导捕获” 的特征参考示例进行操作（Cell Ranger Feature Reference CSV | 10x Genomics）。
 

北京怡美通德科技发展有限公司是10x Genomics的官方授权代理商，代理美国10x Genomics公司生产的Chromium单细胞测序建库系列产品、Visium空间转录组系列产品以及Xenium组织空间原位分析系统，提供仪器配套的试剂耗材供货、产品演示实验、产品安装、使用培训以及售前售后技术咨询、生物信息学分析等相关技术服务。

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