该研究由Alessandro Zunino、Giacomo Garrè、Eleonora Perego、Sabrina Zappone、Mattia Donato、Nadine Vastenhouw 和 Giuseppe Vicidomini 共同完成，研究成果以“Structured detection for simultaneous super-resolution and optical sectioning in laser scanning microscopy”为题，于2025年6月在《Nature Photonics》期刊在线发表。

重要发现
01研究背景与原理
激光扫描显微镜的三维成像能力关键在于光学切片，即分离焦平面以外信号的能力。共聚焦显微镜通过物理针孔实现部分切片，但分辨率和信噪比之间存在明显制约。ISM 技术使用阵列探测器（如SPAD阵列）记录多幅共聚焦类图像，再通过计算融合成一幅图像。传统ISM重建算法如自适应像素重分配（APR）或多图像反卷积虽可提高分辨率，却无法有效抑制离焦光，限制了其在厚样本中的应用。

s²ISM 方法的核心在于将ISM视为结构照明显微镜的一种形式，通过物理模型反演与最大似然估计，显式分离图像中的聚焦与离焦成分。该方法基于以下观察：不同探测器单元所记录的点扩散函数（PSF）不仅存在空间形态差异，其强度分布也随样本深度变化，形成所谓的“指纹特征”。s²ISM 利用这一特性，在迭代重建过程中同时估计聚焦平面和离焦平面的图像，最终丢弃离焦成分，获得高保真的超分辨率切片图像。

结果表明，s²ISM 显著提高了横向分辨率，成功分辨出间距低于衍射极限的线对图案；其光学切片能力较传统ISM提高了一倍，并可有效去除背景荧光，即使这些荧光与聚焦信号寿命相同。此外，s²ISM 还支持技术上采样，实现数字超分辨率，允许在较低采样率下完成高质量成像，有助于减少光毒性和扫描时间。

创新与亮点
01突破传统制约
s²ISM 的主要突破在于彻底解决了ISM技术中“光学切片-信噪比”的权衡问题。传统方法需人为限制探测器尺寸以换取一定切片能力，导致信号严重损失；s²ISM 则充分利用整个探测器阵列接收的光子信息，通过计算实现光学切片，同时保持高探测效率和信噪比。

02技术创新
s²ISM 的核心创新在于提出了一个统一的反演模型，将多探测器图像视为结构探测的结果，并利用指纹编码的轴向信息分离信号。该模型兼容多种成像模式（包括单光子、多光子激发和FLIM），且不依赖硬件改动，可直接应用于现有配备阵列探测器的激光扫描系统。

03应用价值
该方法特别适合活细胞长时间成像、厚组织深层观测以及多色荧光与寿命混合成像场景。其能力在斑马鱼胚胎（深达40 μm）和小脑切片中的表现尤其突出，显示出在复杂生物环境中实现高分辨率、高对比度成像的巨大潜力。

总结与展望
s²ISM 作为一种计算成像方法，成功统一了超分辨率、光学切片和高信噪比这三个传统上难以兼得的目标。其基于物理模型的反演框架不仅具备严谨的理论基础，还具备高度的通用性，可扩展至多光子、荧光寿命、光谱成像等多种模态。未来，s²ISM 有望整合现代去噪算法与自适应光学系统，进一步提升在强散射、高像差环境中的成像性能。此外，由于其开源实现和兼容性，s²ISM 或将成为生物医学研究中高分辨率体成像的新标准工具，推动从细胞器动态观测到组织水平分析的多尺度研究进展。

DOI:10.1038/s41566-025-01695-0.