高分辨荧光标测技术助力进行乳鼠心室肌细胞(NRVM)分离与光标测
2025-09-16 来源:本站 点击次数:79实验概要：
乳鼠心室肌细胞（NRVM）取自出生 1-3 天大鼠心脏心室，经处理后体外可保留核心生物学特性，是心血管研究常用模型。其优势在于平衡 “功能保真度” 与 “实验可操作性”：既高度保留在体心肌功能，比永生化细胞更贴近真实；又可在体外培养成熟、易获高纯度细胞，且实验周期短、成本低，适合大规模初步筛选与机制验证，可为心血管研究搭建桥梁，助力精准解析疾病诱因、加速发病机制破解，并为临床前药物研发提供初筛平台。
在 NRVM 细胞层标测动作电位与钙瞬变，意义在于完整、实时可视化心肌多细胞水平以 “电传导 - 钙活动” 为核心的兴奋 - 收缩耦联全过程，进而精确定位疾病模型或药物干预下的功能紊乱机制（如电信号异常、钙处理缺陷及两者耦联失调），为解析心律失常、心衰等心血管疾病模型机制、开展高通量药物筛选及提升药物心脏安全性评价可靠性提供关键手段。
实验目的：
应用高分辨荧光标测技术，检测乳鼠心室肌细胞层（NRVM）的动作电位时程、动作电位时程离散、传导速度、传导离散度、钙瞬变时程、钙瞬变时程离散、钙传导速度、钙传导离散度等电生理指标。
实验动物：
新生大鼠（3 天左右）
实验方法：
NRVM细胞分离、高分辨荧光标测技术
实验原理：
高分辨荧光标测技术原理：在可兴奋样本上负载荧光染料，通过高速相机记录荧光变化来反应样本中电压或各种离子浓度的变化，可同步记录动作电位与钙信号等电生理指标的改变。
Protocol
（NRVM细胞分离与光标测实验案例）
一、实验前准备
（一）主要试剂：
PBS、DMEM/F12、FBS、胰蛋白酶-EDTA（0.25 %，含酚红）、DNA酶、Ⅱ型胶原酶、青霉素-链霉素 (PS，10000 U/mL)、Rhod-2 AM、Pluronic F127、FluoVolt、1.8 mM含钙台氏液等。
（二）主要器材：
眼科镊、显微镊、眼科剪、显微剪、100 μm细胞筛、培养皿、培养瓶、离心管、滴管等。
（三）主要溶液配方：
1. 胶原酶：1.1 mg/mL Ⅱ型胶原酶+10 mg/mL BSA；
2. 完全培养基：DMEM/F12+ 1 % PS+5 % FBS。
3. 1.8 mM含钙台氏液
4. FluoVolt 工作液：1 µL FluoVolt™ Dye、10 µL PowerLoad™ Concentrate、100 µL Neuro Background Suppressor，混匀后加至 900 µL 含钙台氏液。
二、乳鼠心脏获取与处理
1. 75 % 酒精消毒后，平放乳鼠，沿腋下剪开胸腔，挤出心脏，用剪刀剪取心室，放入PBS中轻轻挤压心脏，排出多余残血；去除心脏残余的心房和血管等组织，只保留心室，转移至干净的PBS中剪碎至约1 mm3大小。
2. 收集所有心脏组织，PBS清洗一遍，使用胰酶置换出残留PBS，4 ℃消化14-16 h。
3. 弃去培养瓶中原有胰酶，使用PBS清洗两遍以去除残留胰酶。
三、NRVM细胞消化与培养
1. 向心脏组织中加入胶原酶清洗，置换出残留PBS，并加入2 mL胶原酶及DNA酶（DNA酶的量根据初次消化液总体积确定1：1000加入），于37 ℃ 水浴锅中轻晃培养瓶消化细胞，时间为1 min 30 s。
2. 将细胞悬液加入到提前配置好的完全培养基中以终止消化。
3. 重复步骤1、2，直到心肌组织残留较少。
4. 使用100 μm的细胞筛过滤细胞悬液，200 g离心5 min，2 mL完全培养基重悬细胞沉淀。
5. 使用细胞培皿/培养瓶培养细胞，并放入到37 ℃ 5 % CO2培养箱中进行差速贴壁2 h。
6. 收集上清液，200 g离心5 min，加入1 mL完全培养基重悬细胞，使用计数仪进行计数。
7. 按照实验要求进行铺板，每2 天更换一次完全培养基，放入37 ℃ 5 % CO2培养箱，培养4-6 天后进行实验。
显微镜下分离得到的NRVM细胞
四、NRVM细胞高分辨荧光标测记录（全过程均在避光环境下进行）
（一）钙瞬变信号记录
1. 弃上清，加入钙指示剂Rhod-2 AM（终浓度为3 μM）和Pluronic F127（0.02 %），放于37 ℃培养箱孵育30 min。
2. 后用含钙台氏液（Ca2+1.8 mM）清洗一遍去除多余的染料，室温下静置30 min充分去酯化。
3. 用520 nm LED灯光激发NRVM细胞层荧光信号，通过光路系统中的二相色镜和不同波长的滤光片分离荧光信号，由高速sCMOS科研相机采集钙离子信号。
NRVM细胞层自发钙瞬变信号记录
NRVM细胞层在点刺激下钙瞬变信号记录-20 mA 1 Hz 2 ms
（二）动作电位信号记录
1. 弃上清，加入足量 FluoVolt 工作液，室温避光孵育 25 min。
2. 弃去染色液，用含钙台氏液轻晃洗涤 2–3 次后即可检测。
3. 用520 nm LED灯光激发NRVM细胞层荧光信号，通过光路系统中的二相色镜和不同波长的滤光片分离荧光信号，由高速sCMOS科研相机采集动作电位信号。
NRVM细胞层自发动作电位信号记录
五、注意事项
剪碎心脏时可在冰盒上进行操作，且过程不宜太久，否则易造成心肌细胞损伤。