基于这些核心优势，小鼠原代心肌细胞在心脏领域研究中具备不可替代的意义：既可为解析成年心脏能量代谢、钙信号调控等生理机制提供直接工具，也能精准构建心肌缺血、心衰等疾病模型以挖掘病理核心环节；还可用于药物心脏毒性筛选与疗效验证，降低临床研发风险，更能支撑心肌再生医学与基因治疗研究，验证外泌体、基因编辑等干预效果，成为连接基础生物学研究与临床疾病治疗转化的关键桥梁。

实验目的：
利用Langendorff离体心脏灌流技术对成年小鼠心肌细胞进行酶解分离。

实验动物：
成年C57BL/6J小鼠

实验方法：
Langendorff灌流法分离心肌细胞。

实验原理：
Langendorff离体心脏灌流技术原理：离体动物心脏在恒温恒流条件下，将心脏套管插入主动脉，逆行灌流含氧的灌注液，由冠状动脉灌流心肌，灌流液经冠状静脉窦从右心房、右心室、肺动脉端流出，以维持离体心脏在外界正常的生理活动。

Protocol
（成年小鼠原代心肌细胞分离实验案例）

一、实验前准备
（一）主要试剂：
肝素钠溶液、灌流液、消化液、终止缓冲液。
（二）主要器材：

灌流针、眼科镊、显微镊、眼科剪、手术剪、100 um细胞筛、注射器、30 mm培养皿、离心管、手术缝线（6-0）、滴管。

（三）主要溶液配方：
1. 灌流液：

pH调节：使用NaOH在35 ℃下调节至pH 7.46；使用0.5 M的NaOH储备溶液进行pH调节。

2. 消化液：
体积： 25 ml/小鼠

3. 终止缓冲液：
体积：20 ml/小鼠

特别说明： 请勿存储，实验当天现配。

二、小鼠心脏获取与处理
1. 为小鼠腹腔注射肝素（350 U/20 g），15-20 分钟后将小鼠颈椎脱臼处死。
2. 将小鼠仰卧固定于手术台上，打开胸腔，切开主动脉和腔静脉，隔离并取出心脏。
3. 将心脏放置在预冷的灌流液中，剪除心脏上的肺、胸腺、脂肪、食管和气管。
4. 暴露主动脉后，将灌流针插入主动脉，用6-0的丝线扎紧主动脉，排除残血后移至Langendorff灌流系统中灌流。
灌流温度：37 ℃；灌流速度：2-4 ml/min。

三、心肌细胞消化
1. 逆行灌注含氧灌流液3-6分钟，排除心脏残血。

2. 逆行灌注消化液5-8分钟后，用无菌剪刀切除心脏的特定心室区域。(根据实验情况调整消化时间)

3. 将切除的心室组织放入2 ml的终止缓冲液中，用剪刀将组织切成小块，用显微镊轻轻挑散组织。
 

4. 加入2 ml终止缓冲液（室温），使细胞悬液与终止缓冲液混合，将混合后的细胞悬液过滤。
 

5. 室温静置30分钟后，缓慢弃去上清液。

显微镜下观察1 Hz刺激下原代心肌细胞的状态

四、注意事项
灌注消化液时，消化时间根据实际情况进行调整。