EMSA探针设计指南：从结合位点预测到特异性探针设计
2025-09-25 来源:本站 点击次数:38在做完筛选或大片段互作实验后，若需进一步精确定位蛋白质与DNA的具体结合位点，EMSA实验往往是理想选择。但实际操作中，面对探针设计、结合位点预测等问题，是否会感到有些无从下手？别担心，今天我们就手把手拆解 EMSA 实验中的探针设计要点，帮你轻松突破这一难关。
EMSA实验原理
EMSA，中文全称为电泳迁移率实验，也被称为凝胶阻滞实验，是研究蛋白质与核酸相互作用的一种经典体外实验技术。其核心原理在于：标记后的核酸探针（常用生物素）与对应结合蛋白特异性结合后，会形成分子量更大的“蛋白质-核酸复合物”；由于该复合物在凝胶中的迁移速度远慢于游离探针，因此在凝胶上会表现为条带的“滞后”或“阻滞”现象，若为生物素标记探针，可通过化学发光法显影；若为放射性或荧光标记，则需对应采用放射自显影或荧光成像检测，最终通过条带判断结合是否发生。这一特性使得EMSA成为检测蛋白质与核酸结合的有效工具。
已知核心结合位点预测
预测目标蛋白的DNA结合位点时，可通过文献资源明确目标蛋白的保守DNA结合结构域、已知结合基序等先验信息，并结合专业数据库提升预测准确性。本文推荐使用JASPAR数据库（收录大量实验验证的转录因子结合基序，支持家族特异性筛选）进行预测。以植物NAC转录因子家族家族为例，可先通过文献确认NAC家族的保守结合基序（如核心序列CACG），再在JASPAR中筛选NAC家族的代表性motif，进而对特定NAC亚型的DNA结合位点进行预测。
JASPAR数据库链接：https://jaspar.elixir.no/，使用JASPAR数据库预测蛋白的结合序列具体操作步骤如下：
EMSA实验原理
EMSA，中文全称为电泳迁移率实验，也被称为凝胶阻滞实验，是研究蛋白质与核酸相互作用的一种经典体外实验技术。其核心原理在于：标记后的核酸探针（常用生物素）与对应结合蛋白特异性结合后，会形成分子量更大的“蛋白质-核酸复合物”；由于该复合物在凝胶中的迁移速度远慢于游离探针，因此在凝胶上会表现为条带的“滞后”或“阻滞”现象，若为生物素标记探针，可通过化学发光法显影；若为放射性或荧光标记，则需对应采用放射自显影或荧光成像检测，最终通过条带判断结合是否发生。这一特性使得EMSA成为检测蛋白质与核酸结合的有效工具。
已知核心结合位点预测
预测目标蛋白的DNA结合位点时，可通过文献资源明确目标蛋白的保守DNA结合结构域、已知结合基序等先验信息，并结合专业数据库提升预测准确性。本文推荐使用JASPAR数据库（收录大量实验验证的转录因子结合基序，支持家族特异性筛选）进行预测。以植物NAC转录因子家族家族为例，可先通过文献确认NAC家族的保守结合基序（如核心序列CACG），再在JASPAR中筛选NAC家族的代表性motif，进而对特定NAC亚型的DNA结合位点进行预测。
JASPAR数据库链接：https://jaspar.elixir.no/，使用JASPAR数据库预测蛋白的结合序列具体操作步骤如下：
1.搜索转录因子家族：在JASPAR网站的搜索栏中输入目标转录因子家族名称“NAC”，点击搜索。
2.选择motif：从搜索结果中挑选出感兴趣的motif，点击“Add to cart”，完成后点击“View cart”进入分析界面。
3.输入序列，设置参数：在红框区域输入待测序列（常见为基因转录起始位点TSS上游2000bp的启动子区域，可含TSS下游200-500bp），需为标准fasta格式，匹配阈值默认是80%，该值代表预测结合位点与数据库中已知motif的序列相似性阈值，若需提高预测的严格性，可将阈值调整为85%，设置完成后点击“Scan”启动分析。
4.解读结果：
分析结果中，需重点关注两项核心信息：
相对评估值（Relative Score）：代表预测结合位点与目标 motif（基序）最优匹配序列的相似性百分比（0-100%），评分越高，序列匹配度越强；
预测的位点（Predicted sequence）：即预测的转录因子结合序列，需结合其标注的链方向（strand）处理，若标注为负链（strand：-），需对该序列进行 “反向互补”；
将处理后的预测序列（正链直接用，负链反向互补后用）在原始序列fasta序列中检索，即可确定结合位点的具体坐标，完成预测。
小技巧：如果数据过多，可通过“Filter“功能缩小范围：输入已确认的保守结合序列即可。
分析结果中，需重点关注两项核心信息：
相对评估值（Relative Score）：代表预测结合位点与目标 motif（基序）最优匹配序列的相似性百分比（0-100%），评分越高，序列匹配度越强；
预测的位点（Predicted sequence）：即预测的转录因子结合序列，需结合其标注的链方向（strand）处理，若标注为负链（strand：-），需对该序列进行 “反向互补”；
将处理后的预测序列（正链直接用，负链反向互补后用）在原始序列fasta序列中检索，即可确定结合位点的具体坐标，完成预测。
小技巧：如果数据过多，可通过“Filter“功能缩小范围：输入已确认的保守结合序列即可。
探针设计
在确定了结合位点之后，接下来的工作便是进行探针的设计。以下是几个核心要点：
探针长度：通常控制在20-40个碱基对之间。序列过短可能导致结合不稳定，过长游离探针迁移变慢、与低分子量蛋白复合物难以有效分离。
核心结合位点：探针应完整包含核心结合位点及其两端各5-15bp的侧翼序列，且核心结合位点应尽量位于探针中央，以确保结合的稳定性和特异性。
探针类型：根据实验需求选择合适的探针类型。
生物素标记探针（野生型，Biotin-WT）：在探针的 5’端或 3’端引入生物素标记，用于后续实验的信号检测。
未标记竞争探针（冷探针，Cold Probe）：与生物素标记探针序列相同，但不含生物素标记，实验中加入过量冷探针，若能竞争性抑制Biotin-WT与目标蛋白的结合（表现为显影条带减弱），可证明结合的特异性（排除非特异性结合）。
突变探针（Biotin-Mut）：侧翼序列与野生型探针相同，将核心结合位点的关键碱基进行突变（如ACGT变为AAAA），若Biotin-Mut无法与目标蛋白结合（显影条带消失），可进一步验证核心结合位点的必要性。
以上就是本期的全部内容啦，希望这篇从JASPAR入手的实战指南能给您带来帮助。如果您在实践过程中遇到任何问题或有自己的心得，欢迎在评论区与我们分享讨论。如果觉得本文有用，也请点个「赞」和「在看」支持一下吧！
在确定了结合位点之后，接下来的工作便是进行探针的设计。以下是几个核心要点：
探针长度：通常控制在20-40个碱基对之间。序列过短可能导致结合不稳定，过长游离探针迁移变慢、与低分子量蛋白复合物难以有效分离。
核心结合位点：探针应完整包含核心结合位点及其两端各5-15bp的侧翼序列，且核心结合位点应尽量位于探针中央，以确保结合的稳定性和特异性。
探针类型：根据实验需求选择合适的探针类型。
生物素标记探针（野生型，Biotin-WT）：在探针的 5’端或 3’端引入生物素标记，用于后续实验的信号检测。
未标记竞争探针（冷探针，Cold Probe）：与生物素标记探针序列相同，但不含生物素标记，实验中加入过量冷探针，若能竞争性抑制Biotin-WT与目标蛋白的结合（表现为显影条带减弱），可证明结合的特异性（排除非特异性结合）。
突变探针（Biotin-Mut）：侧翼序列与野生型探针相同，将核心结合位点的关键碱基进行突变（如ACGT变为AAAA），若Biotin-Mut无法与目标蛋白结合（显影条带消失），可进一步验证核心结合位点的必要性。
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