期刊：Nature Genetics
影响因子：29
主要技术：10x 3′ scRNA-seq   Stereo-seq 空间转录组  空间蛋白组

科学问题
宫颈鳞状细胞癌（CSCC）中肿瘤细胞的异质性如何影响肿瘤免疫微环境（TIME），并进而影响免疫治疗的疗效？

实验材料和方法
14 例初治 CSCC 新鲜手术标本 + 3 例健康宫颈：10x 3′ scRNA-seq
同上组织（OCT 包埋 10 μm 片）：Stereo-seq 空间转录组
60 个激光捕获微切割（LCM）ROI（免疫富集区 40 个、免疫贫乏区 20 个）：空间蛋白组

导语
同一批宫颈鳞癌，有的对免疫治疗“冷若冰霜”，有的却“热情响应”。同济团队发表Nature Genetics 研究用单细胞+空间多组学给肿瘤“拍CT”，揪出两种决定免疫命运的核心细胞状态——MP6（冷）与MP7（热）。机制上，MP6通过FABP5-TGFβ信号把免疫细胞挡在瘤外；临床上，一次新辅助化疗即可“降温转热”，显著提增PD-1疗效。这项工作为精准免疫治疗提供了可量化的分子标尺和可成药的新靶点。

主要技术
10x 3′ scRNA-seq   Stereo-seq 空间转录组  空间蛋白组

研究结果
1. CSCC单细胞图谱
研究团队对14例未经治疗的宫颈鳞癌及3例健康宫颈组织进行10x scRNA-seq（图1a-b），质控后获得163,880个高质量单细胞，并基于经典marker注释出50种亚型、14大细胞谱系。拷贝数与突变分析（扩展图1d-e）证实肿瘤特异性。

2. CSCC恶性区室内的元程序
恶性上皮细胞的转录异质性会与肿瘤免疫微环境（TIME）形成特定的相互作用，从而影响肿瘤的命运。因此，我们开始评估宫颈鳞癌中鳞状上皮细胞的细胞状态多样性。与以往研究一致，20,168个恶性鳞状细胞根据其肿瘤来源明显聚类，表现出肿瘤间的异质性（图1c）。通过对每个恶性细胞应用非负矩阵分解（NMF），我们识别出8种不同的“元程序”（MP1–8），它们反映了不同肿瘤内部异质性的共同模式（图1d）。值得注意的是，这些元程序也可以通过其他聚类方法稳定地识别出来（扩展数据图2a,b）。其中三个元程序（MP6、MP7 和 MP8）代表了鳞状分化的不同阶段，其特征基因主要由角蛋白、黏蛋白和富含脯氨酸的小蛋白家族等上皮标志物组成（图1d）。MP6（上皮-角蛋白型）与头颈鳞癌的HNSCC_epi2特征高度一致，但与泛癌研究中的上皮衰老（Epi-Sen）状态相似度较低，富集角化相关基因，突出其鳞癌特异性。MP8（上皮衰老型）与头颈鳞癌的HNSCC_epi1状态和泛癌的衰老上皮状态相似，表现出与HPV状态相关的衰老特征。MP7（上皮-免疫型）表达多种与免疫细胞相关的分子（如HLA-DRB、B2M和IDO1），表明其与免疫反应有关。此外，MP7同时表达鳞状上皮标志物（如KRT5和KRT6）和腺体标志物（如MUC1、MUC16和WFDC2）。MP7与泛癌免疫信号和干扰素（IFN）反应细胞不同，表明它可能代表一种此前未被报道的、独特的免疫相关上皮状态。

图1 单细胞RNA测序解析细胞图谱，为揭示宫颈鳞癌异质性提供全新视角

3. MP6 和 MP7 与不同的肿瘤免疫表型（TIP）相关
除了数量，CD8+ T 细胞的空间分布对免疫微环境分层和免疫治疗反应也很关键。为了评估 MP 与 TIP 的关系，我们根据 CD8+ T 细胞的分布位置为每个肿瘤分配了一个 TIP 类型，浸润型 TIP 的 CD8+ T 细胞数量显著更多，排斥/荒漠型肿瘤中 MP6 细胞比例更高，而浸润型肿瘤中 MP7 细胞比例更高（图2）。MP6/MP7 的比例，直接决定了肿瘤对免疫治疗的“开门”程度。

图2 MP7状态与大量趋向细胞毒性/耗竭状态的肿瘤浸润性T细胞密切相关

4. MP7的空间分布特征不同于常规的"免疫热"特征
为了在空间水平评估MP6、MP7与免疫细胞浸润的关系，我们把单细胞数据与15例CSCC的Stereo-seq空间转录组数据整合。MP7区域周围CD4 T、CD8 T、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞明显更多（图3b–f）。相反，MP6区域与免疫细胞呈负相关（图3g–h）。CytoSPACE映射显示，CD4和CD8 T细胞明显聚集在MP7区域。此外，MP7区域内的CD4和CD8 T细胞表现出耗竭信号。MP6高表达SERPINB3和FABP5，MUC4染色稀少，几乎没有CD8 T细胞浸润。

图3 空间转录组学揭示MP6和MP7与免疫细胞浸润存在截然相反的关联

5. MP6中TGFβ信号(转化生长因子β信号)被激活
MP6肿瘤细胞富集角化相关基因表达（如 FABP5、SERPINB3、KRT6B 等）， MP7肿瘤细胞高表达抗原提呈和免疫反应相关基因。PROGENy通路分析显示发现MP6型肿瘤细胞和免疫细胞稀少的区域中TGF-β信号更强，提示其可能参与免疫抑制。TGF-β信号介导免疫抑制，而FABP5在肿瘤细胞和成纤维细胞中增强该通路活性。这些发现表明，TGF-β信号在MP6型肿瘤中有助于形成免疫排斥型微环境。在空间转录组和蛋白组中，MP6区域和免疫贫瘠区都一致显示TGFβ信号增强（图4f–g）。并且GF-β 信号强度在 MP6 肿瘤区域的边缘最为突出（图 4g），暗示该通路可重塑肿瘤周围微环境，影响癌相关成纤维细胞（CAFs）及免疫细胞的功能与分布。

图4 多模态肿瘤状态分析证实 MP6 肿瘤存在 TGFβ 信号激活

6. 癌症相关成纤维细胞（CAF）强化了MP6区域周边的免疫抑制微环境
近期研究发现，不同表型的癌相关成纤维细胞（CAF）与不同的肿瘤免疫表型（TIP）密切相关。我们共鉴定到 7 个成纤维细胞亚群，其中 3 个（CAF-CD34、CAF-DES、CAF-MMP11）在宫颈鳞癌中特异性扩张。CAF-MMP11高表达MMP11、POSTN、CTHRC1、COL8A1、COL10A1等TGF-β诱导的反应性基质基因，并富集上皮-间质转化（EMT）及细胞外基质重塑相关通路（图5d,e）。此外，该亚群还高表达LRRC15（图5f），可直接抑制抗肿瘤免疫反应。因此，CAF-MMP11被定义为免疫抑制型CAF。空间转录组显示，MP6 肿瘤周边的成纤维细胞显著高表达免疫抑制 CAF 特征（图 5g 左）。单细胞空间映射进一步证实，CAF-MMP11 主要富集在 MP6 区域的肿瘤-基质交界带，而 MP7 周围无此现象（图 5g 右）。相关性分析表明，MP6 得分与成纤维细胞邻区内的免疫抑制 CAF 特征呈显著正相关（r = 0.55，P = 3.8 × 10⁻⁷）（图 5h）。此外，细胞互作分析揭示 MP6 灶边缘的 TGF-β 信号显著升高。

图5 MP6肿瘤边缘的免疫抑制型CAF形成免疫排斥微环境

7. MP6/7 评分具有临床相关性
为了进一步探索肿瘤状态与免疫表型的特异性关联，我们利用 BayesPrism 工具从 bulk RNA-seq 数据中提取肿瘤细胞特异性基因谱，并解析每个肿瘤中 MP6 与 MP7 的成分。我们定义了一个评分（MP6/7 评分），用于衡量每个肿瘤中 MP6 相对于 MP7 的富集程度（MP6/7 评分 = MP6 特征强度 − MP7 特征强度，越高代表肿瘤越偏向“冷”表型。）。MP6/7 评分高的肿瘤表现出免疫激活和免疫逃逸相关基因表达下降，免疫细胞浸润减少，而免疫排斥相关的基质成分增加（图6a）。在宫颈鳞癌队列中，CD8⁺ T 细胞浸润与 MP6/7 评分呈显著负相关（r = –0.47，P = 0.037）(图6c)。TCGA-CESC 数据重复了上述结果，且在两项鳞状非小细胞肺癌免疫治疗试验（OAK 与 POPLAR）中，低 MP6/7 评分预示免疫检查点抑制剂疗效更佳（图 6d-f）。新辅助化疗显著降低 CSCC 患者的 MP6/7 评分，其中评分下降最显著者随后在接受免疫治疗时达到病理完全缓解。此外，MP6/7 评分与角化程度相关，与 MP6 富集角化基因的结果一致。

图6 MP6肿瘤细胞表型与免疫浸润呈负相关，这一现象在多个CSCC数据集中得到验证

8. FABP5 维持 MP6 肿瘤状态的核心驱动作用
在宫颈鳞癌中，MP6 与 MP7 肿瘤状态更多与表观遗传修饰相关，而非基因组多样性。 我们接着解析 MP6 状态的核心特征。除角化相关基因外，还包含 SERPINB3 和 S100A8/A9，二者均与宫颈鳞癌晚期及不良预后相关。有趣的是，差异表达最显著的转录本与蛋白之一是 FABP5 (Fig. 4a,d)，该脂肪酸结合蛋白已在多种肿瘤中被报道。敲低 FABP5 后，MP6 特征得分下降最为显著，且宫颈鳞癌及头颈鳞癌细胞系中相应蛋白水平也大幅降低（图 7a、b）。FABP5 选择性抑制剂 FABP5-IN-1 可抑制宫颈鳞癌患者来源类器官的生长，并伴随 S100A8/A9 和 SERPINB3 的下调（图 7c、d）。基因敲除或药物抑制 FABP5 均显著降低 TGFβ（特别是 TGFβ2 亚型）及其下游 pSMAD2/3 信号（图 7e–h）。FABP5 敲除肿瘤细胞的条件培养基无法诱导成纤维细胞表达免疫抑制性 CAF 标志，说明 FABP5 依赖的 TGFβ 活性是 CAF 转化的必要条件。体内实验中，抑制或敲除 FABP5 显著降低肿瘤负荷，增加 CD4⁺ 与 CD8⁺ T 细胞浸润，并在免疫功能正常的小鼠中几乎完全阻止肿瘤生长（图 7j–n）。

图7  FABP5是维持MP6状态的关键因子，并参与激活TGFβ信号通路及与免疫抑制性CAF的相互作用。

结语
本项研究通过整合单细胞转录组、空间转录组、空间蛋白质组等多组学技术，系统性地绘制了宫颈鳞癌（CSCC）的高分辨率细胞图谱，并揭示了其内部的关键异质性。研究成功鉴定出三种具有重要生物学和临床意义的肿瘤细胞状态（MP6, MP7, MP8），其中MP6（上皮-角蛋白型）与免疫排斥微环境相关，而MP7（上皮-免疫型）则与免疫细胞浸润密切相关。研究进一步阐明了其背后的分子机制：MP6细胞通过FABP5-TGFβ信号轴与周围的免疫抑制性癌症相关成纤维细胞（CAF）形成双向正反馈循环，共同构筑了一个“免疫隔离区”；而MP7细胞则通过干扰素等信号与免疫细胞积极互动。

更重要的是，本研究超越了基础机制的探索，展现了巨大的临床转化潜力。基于此发现的MP6/7评分不仅能作为预测免疫治疗响应的新型生物标志物，还揭示了新辅助化疗可诱导肿瘤细胞状态从MP6向MP7发生有利转换，从而为联合治疗策略提供了理论依据。最后，研究证实靶向FABP5能有效逆转MP6状态、抑制肿瘤生长并促进T细胞浸润，为治疗免疫“冷”肿瘤提供了新的潜在治疗靶点。这项工作不仅深化了我们对宫颈鳞癌肿瘤生态系统复杂性的理解，更开创了一个将肿瘤细胞内在状态与免疫微环境联系起来的研究范式，为改善宫颈癌患者的精准分型和免疫治疗策略提供了强有力的科学依据。

参考文献：
Fan J, Lu F, Qin T, Peng W, Zhuang X, Li Y, Hou X, Fang Z, Yang Y, Guo E, Yang B, Li X, Fu Y, Kang X, Wu Z, Han L, Mills GB, Ma X, Li K, Wu P, Ma D, Chen G, Sun C. Multiomic analysis of cervical squamous cell carcinoma identifies cellular ecosystems with biological and clinical relevance. Nat Genet. 2023 Dec;55(12):2175-2188. doi: 10.1038/s41588-023-01570-0. Epub 2023 Nov 20. PMID: 37985817.