PI3K之P85蛋白的WB检测结果常见问题及解决方法
2025-09-25 来源:本站 点击次数:48
说起磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks），大家都不陌生，大量研究表明其是癌症、血栓形成、炎症及免疫性疾病的重要治疗靶点[1]。尤其是p85/p-p85蛋白，更是多种通路研究绕不开的热点。然而科研的成功不会像山坡上的蒲公英那样唾手可得，在进行WB检测p85/p-p85时，时常会遇到一些棘手的问题让人苦恼不已。今天小优细节君就来和大家聊一聊p85/p-p85检测的二三事。
PI3Ks是一个脂质激酶家族，可以通过磷酸化细胞内肌醇脂质来调节信号传导和细胞内小泡运输。哺乳动物有八种PI3K亚型，分为三类。I类PI3Ks产生3-磷酸肌醇脂质，其直接激活信号转导途径。除了在癌症中经常被基因激活外，在人类非恶性过度生长综合征和易患淋巴瘤的原发性免疫疾病中也发现了I类PI3K的类似突变。II类和III类PI3K是内吞途径、内体循环和自噬中膜交通的调节因子，通常对细胞信号传导具有间接影响[2]。目前I类PI3Ks的研究最为广泛。
I类PI3K是p110催化亚基与调控亚基复合的异二聚体，根据调节亚基的差异，I类PI3K被细分为IA类和IB类酶。其中IA类酶包括催化亚基（p110α、p110β和p110δ）与p85调节亚基，哺乳动物有三个编码p85亚基的基因：PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3，其中，PIK3R1编码p85α、p55α、p50α，这是由于可变剪切造成的，PIK3R2和PIK3R3则分别编码p85β和p55γ。这些亚型中，p85α和p85β多肽在大多数细胞中表达，而其他亚型的表达则有限[3]。
IA类PI3K催化亚基与调节亚基复合形成的p85–p110异二聚体在胞质中保持无活性的状态。通过p85的SH2结构域与酪氨酸磷酸化蛋白（如受体酪氨酸激酶）或其他膜结合蛋白（如胰岛素受体底物蛋白）的结合，被募集到质膜。这种募集可以使p85–p110二聚体去抑制，并与胞膜中的脂质底物结合。一项研究通过质谱方法和具有内源性标记IA类亚基的小鼠模型进行实验表明，p85α和p85β与p110α和p110β等效结合，而p85α优先与p110δ相互作用。同时，该研究还为存在不与p110结合的独立p85亚基提供了证据[4]。一些研究还表明p55蛋白与成纤维细胞内钙释放相关[5]，还可参与细胞周期调节[6]，并且一些给药处理可能使其与p85表现相反的表达趋势[7]。
经过前面的介绍，相信大家已经对p85/p-p85蛋白的相关信息和研究有了进一步的了解，在此基础上，我们也一起来看看，关于WB实验中p85/p-p85蛋白检测时可能会遇到的一些问题和排查的方法。
在我们检测p85/p-p85条带时，常会遇到这样的结果，得到的条带中既有85KD的蛋白条带，也有55KD附近的条带。根据前文我们可以知道，这很可能是由于可变剪切造成的，我们可以先查阅文献及数据库如uniprot等，辅助判断一下样本中是否可能存在50KD附近的isoform。如果是检测p-p85，可以结合p85的结果综合判断，如两组检测结果均存在50KD附近的条带，可以认为是可变剪切的蛋白条带。如果想要进一步确定条带的特异性，还可以通过更换样本以及设计敲除实验进行验证。
除去上述检测到多条带的情况，还有时会出现仅检测到55KD条带的情况，多发生在p-p85蛋白的检测中，这种情况下首先可以尝试遮挡50KD处进行曝光，看下85KD处是否可以显出条带，避免因50KD处信号条带过强，显影时掩盖了85KD处的信号；其次，在下图中，我们可以看到，检测p85时，85KD和50KD附近均有清晰且明显的条带，推测50KD附近条带时可变剪切体的磷酸化条带。这时，还可以使用去磷酸化的碱性磷酸酶对转印后的膜进行处理，或使用λ磷酸酶处理样本再进行检测，看下50KD处条带是否依然存在，如处理后条带消失，说明其是磷酸化的剪切体。另外，这种情况也可以通过更换样本进行检测辅助判断。
在常见的多条带和条带位置与预期不符以外，还可能会出现无条带的情况，这时我们可以先查询文献及数据库，如HPA、BioGPS等初步判断一下p85在样本中的表达水平如何。如样本中靶标蛋白的表达量偏低，可以在提取蛋白时进行超声处理，提高蛋白提取效率，并适当提高蛋白上样量。也可以使用一些高表达的样本同时进行WB检测，排查是否是样本原因导致了无信号的结果，还可以更换免疫位点不同的抗体进行实验，排查无信号的具体原因，从而解决问题。
另外由于p85蛋白存在可变剪切体的形式，在初次进行实验时，建议保留完整的膜进行检测，先确定样本中目的蛋白的具体分子量，避免因裁膜范围不当，导致目的蛋白丢失，影响实验结果。
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[2] Bilanges B, Posor Y, Vanhaesebroeck B. PI3K isoforms in cell signalling and vesicle trafficking. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Sep;20(9):515-534. doi: 10.1038/s41580-019-0129-z. PMID: 31110302.
[3] Amzel LM, Huang CH, Mandelker D, Lengauer C, Gabelli SB, Vogelstein B. Structural comparisons of class I phosphoinositide 3-kinases. Nat Rev Cancer. 2008 Sep;8(9):665-9. doi: 10.1038/nrc2443. PMID: 18633356; PMCID: PMC2847604.
[4] Tsolakos, N. et al. Quantitation of class IA PI3Ks in mice reveals p110-free-p85s and isoform- selective subunit associations and recruitment to receptors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, 12176–12181 (2018)
[5] Farrar CS, Hocking DC. Assembly of fibronectin fibrils selectively attenuates platelet-derived growth factor-induced intracellular calcium release in fibroblasts. J Biol Chem. 2018 Nov 30;293(48):18655-18666. doi: 10.1074/jbc.RA118.004020. Epub 2018 Oct 15. PMID: 30323067; PMCID: PMC6290149.
[6] Xia C, He Z, Cai Y, Liang S. Vorinostat upregulates MICA via the PI3K/Akt pathway to enhance the ability of natural killer cells to kill tumor cells. Eur J Pharmacol. 2020 May 15;875:173057. doi: 10.1016/j.ejphar.2020.173057. Epub 2020 Mar 2. PMID: 32135122.
[7] He B, Guo W, Shi R, Hoffman RD, Luo Q, Hu YJ, Gao J. Ruyong formula improves thymus function of CUMS-stimulated breast cancer mice. J Ethnopharmacol. 2023 Sep 16;319(Pt 1):117164. doi: 10.1016/j.jep.2023.117164. Epub ahead of print. PMID: 37717843.
PI3Ks是一个脂质激酶家族，可以通过磷酸化细胞内肌醇脂质来调节信号传导和细胞内小泡运输。哺乳动物有八种PI3K亚型，分为三类。I类PI3Ks产生3-磷酸肌醇脂质，其直接激活信号转导途径。除了在癌症中经常被基因激活外，在人类非恶性过度生长综合征和易患淋巴瘤的原发性免疫疾病中也发现了I类PI3K的类似突变。II类和III类PI3K是内吞途径、内体循环和自噬中膜交通的调节因子，通常对细胞信号传导具有间接影响[2]。目前I类PI3Ks的研究最为广泛。
I类PI3K是p110催化亚基与调控亚基复合的异二聚体，根据调节亚基的差异，I类PI3K被细分为IA类和IB类酶。其中IA类酶包括催化亚基（p110α、p110β和p110δ）与p85调节亚基，哺乳动物有三个编码p85亚基的基因：PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3，其中，PIK3R1编码p85α、p55α、p50α，这是由于可变剪切造成的，PIK3R2和PIK3R3则分别编码p85β和p55γ。这些亚型中，p85α和p85β多肽在大多数细胞中表达，而其他亚型的表达则有限[3]。
Fig.1 I类PI3K的IA类结构示意图
IA类PI3K催化亚基与调节亚基复合形成的p85–p110异二聚体在胞质中保持无活性的状态。通过p85的SH2结构域与酪氨酸磷酸化蛋白（如受体酪氨酸激酶）或其他膜结合蛋白（如胰岛素受体底物蛋白）的结合，被募集到质膜。这种募集可以使p85–p110二聚体去抑制，并与胞膜中的脂质底物结合。一项研究通过质谱方法和具有内源性标记IA类亚基的小鼠模型进行实验表明，p85α和p85β与p110α和p110β等效结合，而p85α优先与p110δ相互作用。同时，该研究还为存在不与p110结合的独立p85亚基提供了证据[4]。一些研究还表明p55蛋白与成纤维细胞内钙释放相关[5]，还可参与细胞周期调节[6]，并且一些给药处理可能使其与p85表现相反的表达趋势[7]。
经过前面的介绍，相信大家已经对p85/p-p85蛋白的相关信息和研究有了进一步的了解，在此基础上，我们也一起来看看，关于WB实验中p85/p-p85蛋白检测时可能会遇到的一些问题和排查的方法。
在我们检测p85/p-p85条带时，常会遇到这样的结果，得到的条带中既有85KD的蛋白条带，也有55KD附近的条带。根据前文我们可以知道，这很可能是由于可变剪切造成的，我们可以先查阅文献及数据库如uniprot等，辅助判断一下样本中是否可能存在50KD附近的isoform。如果是检测p-p85，可以结合p85的结果综合判断，如两组检测结果均存在50KD附近的条带，可以认为是可变剪切的蛋白条带。如果想要进一步确定条带的特异性，还可以通过更换样本以及设计敲除实验进行验证。
除去上述检测到多条带的情况，还有时会出现仅检测到55KD条带的情况，多发生在p-p85蛋白的检测中，这种情况下首先可以尝试遮挡50KD处进行曝光，看下85KD处是否可以显出条带，避免因50KD处信号条带过强，显影时掩盖了85KD处的信号；其次，在下图中，我们可以看到，检测p85时，85KD和50KD附近均有清晰且明显的条带，推测50KD附近条带时可变剪切体的磷酸化条带。这时，还可以使用去磷酸化的碱性磷酸酶对转印后的膜进行处理，或使用λ磷酸酶处理样本再进行检测，看下50KD处条带是否依然存在，如处理后条带消失，说明其是磷酸化的剪切体。另外，这种情况也可以通过更换样本进行检测辅助判断。
在常见的多条带和条带位置与预期不符以外，还可能会出现无条带的情况，这时我们可以先查询文献及数据库，如HPA、BioGPS等初步判断一下p85在样本中的表达水平如何。如样本中靶标蛋白的表达量偏低，可以在提取蛋白时进行超声处理，提高蛋白提取效率，并适当提高蛋白上样量。也可以使用一些高表达的样本同时进行WB检测，排查是否是样本原因导致了无信号的结果，还可以更换免疫位点不同的抗体进行实验，排查无信号的具体原因，从而解决问题。
另外由于p85蛋白存在可变剪切体的形式，在初次进行实验时，建议保留完整的膜进行检测，先确定样本中目的蛋白的具体分子量，避免因裁膜范围不当，导致目的蛋白丢失，影响实验结果。
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参考文献：
[1] Miller MS, Thompson PE, Gabelli SB. Structural Determinants of Isoform Selectivity in PI3K Inhibitors. Biomolecules. 2019 Feb 26;9(3):82. doi: 10.3390/biom9030082. PMID: 30813656; PMCID: PMC6468644.[2] Bilanges B, Posor Y, Vanhaesebroeck B. PI3K isoforms in cell signalling and vesicle trafficking. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Sep;20(9):515-534. doi: 10.1038/s41580-019-0129-z. PMID: 31110302.
[3] Amzel LM, Huang CH, Mandelker D, Lengauer C, Gabelli SB, Vogelstein B. Structural comparisons of class I phosphoinositide 3-kinases. Nat Rev Cancer. 2008 Sep;8(9):665-9. doi: 10.1038/nrc2443. PMID: 18633356; PMCID: PMC2847604.
[4] Tsolakos, N. et al. Quantitation of class IA PI3Ks in mice reveals p110-free-p85s and isoform- selective subunit associations and recruitment to receptors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, 12176–12181 (2018)
[5] Farrar CS, Hocking DC. Assembly of fibronectin fibrils selectively attenuates platelet-derived growth factor-induced intracellular calcium release in fibroblasts. J Biol Chem. 2018 Nov 30;293(48):18655-18666. doi: 10.1074/jbc.RA118.004020. Epub 2018 Oct 15. PMID: 30323067; PMCID: PMC6290149.
[6] Xia C, He Z, Cai Y, Liang S. Vorinostat upregulates MICA via the PI3K/Akt pathway to enhance the ability of natural killer cells to kill tumor cells. Eur J Pharmacol. 2020 May 15;875:173057. doi: 10.1016/j.ejphar.2020.173057. Epub 2020 Mar 2. PMID: 32135122.
[7] He B, Guo W, Shi R, Hoffman RD, Luo Q, Hu YJ, Gao J. Ruyong formula improves thymus function of CUMS-stimulated breast cancer mice. J Ethnopharmacol. 2023 Sep 16;319(Pt 1):117164. doi: 10.1016/j.jep.2023.117164. Epub ahead of print. PMID: 37717843.
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