英文名：Transcriptomics sequencing reveals Qu-shi-yu-fa Decoction promotes hair cycle and keratinization by upregulating FOXN1 and TGM3 to treat androgenetic alopecia
杂志：Phytomedicine
影响因子：8.3
发表时间：2025年5月12日
研究背景：雄激素性脱发(AGA)影响超过90%的脱发患者，且男性更为常见。祛湿育发汤(QSYF)是一种传统中药方剂，在临床实践中对AGA显示出积极效果，但其确切治疗机制尚未完全阐明。
研究思路：本研究首先通过UPLC-MS/MS分析鉴定QSYF的活性成分，建立C57BL/6小鼠的AGA模型评估QSYF效果，通过皮肤镜观察毛发生长情况，组织学检查皮肤组织，对小鼠皮肤样本进行RNA-seq以确定生物过程和靶点，通过Western blotting、RT-PCR和免疫荧光测定评估RNA-seq分析获得的生物过程和靶点，使用靶点抑制剂处理小鼠并观察毛发生长进行反向验证，利用网络药理学确定靶点发挥作用的关键信号通路，并通过Western blotting进行验证。

研究结果：
1、祛湿育发汤（QSYF）的化学成分表征
总离子流图如图1所示。已鉴定出的成分包括15种黄酮类化合物、6种有机酸以及其他成分。
 
2、祛湿育发汤（QSYF）促进雄激素性脱发（AGA）模型小鼠毛发生长
本研究率先探究了QSYF在AGA模型中的治疗效果，具体造模流程与给药方法详见图2A。为直观评估治疗效果，我们在小鼠脱毛后第0、3、7、10、14、17和21天进行拍照（图2B）。对小鼠皮肤颜色进行量化评分，评分标准见图2C。结果显示（图2D），脱毛后第3天起，AGA模型组小鼠的皮肤颜色评分开始低于对照组，而经非那雄胺和QSYF处理后，小鼠皮肤颜色评分显著升高。各组小鼠体重无显著差异（图2E）。上述结果提示，QSYF可促进AGA模型小鼠毛发再生。
 
3、祛湿育发汤（QSYF）增加皮肤厚度与毛球直径，改善毛囊周期
小鼠皮肤镜结果（图3A）与整体拍照结果一致。小鼠皮肤组织苏木精-伊红（HE）染色结果（图3B）显示，脱毛后第0天，各组毛球大小和皮肤厚度无显著差异，说明此阶段各组小鼠毛囊处于相同周期阶段。脱毛后第7天，对照组毛囊进入生长期，毛球直径和皮肤厚度（图3C、G）显著大于AGA模型组，而AGA模型组毛囊仍处于休止期。脱毛后第10天和第14天（图3D、E、H、I）。上述结果表明，QSYF可增加皮肤厚度和毛球直径，改善毛囊周期。
 
4、祛湿育发汤（QSYF）通过上调毛囊周期与角化过程治疗雄激素性脱发（AGA）
为阐明QSYF治疗AGA的分子机制，对小鼠皮肤组织进行了精细的mRNA测序（RNA-seq）（图4A），并通过热图展示AGA模型组与QSYF处理组之间的差异表达基因（DEGs）（图4B）。
将这些差异表达基因用于基因本体论-生物学过程（GO-BP）分析，并筛选出与脱发相关的生物学过程进行作图（图4C），发现这些基因主要富集于角化、毛囊周期、皮肤发育等生物学过程。为探究QSYF如何调控这些生物学过程，我们进行了基因集富集分析（GSEA），结果显示QSYF可上调角化、毛囊周期和皮肤发育相关生物学过程（图4D、E、F）；随后对其中差异基因对应的蛋白质进行相互作用分析，并计算其度值和中期值，为后续深入研究奠定基础。
5、祛湿育发汤（QSYF）通过激活WNT信号通路、增强毛囊活性改善毛囊周期
为探究QSYF作用的详细机制，对皮肤组织进行Ki67染色（图5A、B）。检测了小鼠皮肤组织中与WNT信号通路相关的蛋白质，蛋白质印迹法（Western blot）结果（图5C）显示，DHT处理后，小鼠皮肤组织中Wnt3a和β-连环蛋白（β-Catenin）的蛋白表达显著下调（p<0.05），糖原合成酶激酶-3β（Gsk-3β）的磷酸化水平显著降低（p<0.05），而非那雄胺和QSYF处理可逆转这一现象（图5D、E、F）。β-连环蛋白（β-Catenin）的免疫荧光染色结果（图5I）与Western blot结果一致。定量PCR结果（图5G、H）也与上述结果一致，QSYF处理可调控WNT3A和β-连环蛋白（β-Catenin）的转录水平。上述结果提示，QSYF可激活WNT信号通路，促进毛囊乳头细胞增殖。
6、祛湿育发汤（QSYF）上调FOXN1和TGM3的表达
统计了6个检测样本中TGM3和FOXN1的相对转录水平（图6A），结果显示，QSYF处理后，FOXN1和TGM3的转录水平显著升高（图6B、C）。因此，将FOXN1和TGM3选定为QSYF调控毛囊周期和角化过程的核心靶点。Western blot和免疫组织化学染色技术检测小鼠皮肤组织中FOXN1和TGM3的表达，结果一致显示，QSYF可促进AGA模型小鼠皮肤组织中FOXN1和TGM3的表达（图6D-I）。QSYF处理可提高小鼠皮肤中FOXN1和TGM3的转录水平。综上，我们确定QSYF可在转录水平和蛋白表达水平上上调皮肤组织中FOXN1和TGM3的表达。
7、抑制FOXN1和TGM3加重雄激素性脱发（AGA）
为明确证实叉头框蛋白N1（FOXN1）和转谷氨酰胺酶3（TGM3）是祛湿育发汤（QSYF）发挥治疗作用的核心靶点，分别用生理盐水、LDN193189（骨形态发生蛋白（BMP）信号通路抑制剂，FOXN1是BMP信号通路下游的转录因子）、半胱胺（转谷氨酰胺酶抑制剂）以及LDN193189与半胱胺的混合物处理雄激素性脱发（AGA）模型小鼠，实验期间持续给予31.4g/kg剂量的QSYF。
结果显示，半胱胺组、LDN193189组以及半胱胺+LDN193189组小鼠的毛发生长均受到抑制，毛发生长速度慢于31.4g/kgQSYF单独处理组，且半胱胺+LDN193189组的毛发生长抑制效果最为显著（图7A）。皮肤镜结果（图7B）与上述结果一致。
皮肤颜色评分结果显示（图7D），脱毛后第10天、14天和17天，31.4g/kgQSYF组小鼠的皮肤颜色评分高于其余各组；其中，TGM3和FOXN1同时被抑制的半胱胺+LDN193189组，其皮肤颜色评分始终最低。
 
苏木精-伊红（HE）染色结果（图8A）显示，脱毛后第10天、14天和17天，31.4g/kg QSYF组小鼠的皮肤颜色评分显著高于其余各组；且该组小鼠的毛球直径和皮肤厚度均显著大于半胱胺+LDN193189组（图8B-G）。上述结果表明，QSYF通过作用于TGM3和FOXN1发挥治疗AGA的作用。
8、网络药理学揭示祛湿育发汤（QSYF）治疗雄激素性脱发（AGA）的潜在信号通路
网络药理学方法探究祛湿育发汤（QSYF）的作用机制。通过数据库与筛选QSYF的可能成分，获得了97种活性成分对应的264个作用靶点（图9A）。之后将药物靶点、疾病靶点与mRNA测序（RNA-seq）获得的差异基因进行交集分析（图9B）。借助String数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（图9C），发现AKT1、MAPK1等基因的度值较高。对这53个核心靶点进行基因本体论（GO）富集分析，结果显示它们主要与细胞群体增殖、转录调控复合物、转录因子结合等功能相关（图9D）。KEGG富集分析发现，QSYF治疗AGA所涉及的信号通路包括磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等（图9E）。上述结果揭示了QSYF治疗AGA的潜在信号通路。
 
9、祛湿育发汤（QSYF）激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）信号通路
多项研究表明，TGM3可通过磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路发挥治疗作用。因此，从逻辑上而言，接下来探究了TGM3介导的生物学过程是否通过上述信号通路实现。
经QSYF处理后，AGA模型小鼠背部皮肤中PI3K和AKT的激活水平显著升高（图9F、G、H），这表明PI3K-Akt信号通路被激活；同时，MEK（丝裂原活化蛋白激酶激酶）和ERK（细胞外调节蛋白激酶）的磷酸化水平也显著升高，这提示MAPK信号通路被触发。上述结果表明，QSYF可通过激活PI3K-Akt和MAPK信号通路，调控角化过程；（同时，QSYF也可通过相关）信号通路调控毛囊周期与角化过程。
  总结：本研究首次证明QSYF通过上调FOXN1的表达调节毛周期，并通过上调TGM3的表达促进角化，两者共同发挥治疗AGA的作用。研究不仅为中药疗法的多靶点多通路研究提供了有价值的见解，也为QSYF治疗AGA提供了理论基础。星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！