单细胞打印加速In Vivo CAR-T抗癌新疗法
2025-10-11 来源:本站 点击次数:37随着细胞治疗领域的快速发展，In Vivo CAR-T（体内CAR-T）疗法成为行业新焦点。与传统体外制备CAR-T不同，这项技术只需向患者体内注射携带CAR基因的病毒载体，便能直接在体内“就地”改造T细胞，大大简化治疗流程，为患者争取宝贵时间。
01 巨头押注，In Vivo CAR-T站上风口
2025年，In Vivo CAR-T领域捷报频传：阿斯利康以总价10亿美元收购EsoBiotec，将其工程化纳米抗体慢病毒平台收入囊中；艾伯维则以高达21亿美元全现金收购了专注于该领域的Capstan Therapeutics。
巨头的巨额押注，凸显了In Vivo CAR-T的巨大潜力。相比传统体外CAR-T，其优势显著：
1 流程简化
摆脱复杂的个体化生产流程，患者无需经历细胞采集、体外改造、扩增回输等漫长过程。
2 成本降低
治疗成本有望大幅下降，让更多患者受益。
专家观点：易慕峰生物研发中心负责人郝瑞栋博士指出：“我们的全新In Vivo技术平台，成功打破了国外企业在关键元件上的专利壁垒。”
临床层面，易慕峰基于慢病毒载体的平台已在临床前展现出出色性能。而EsoBiotec的ESO-T01作为第1个进入人体试验的体内BCMA CAR-T候选药物，在复发/难治性多发性骨髓瘤患者中实现了100%的客观缓解率，成果令人鼓舞。
表1：In Vivo与Allo CAR-T核心特点与临床进展对比表
02 慢病毒载体：体内CAR-T的“基因快递员”
在In Vivo CAR-T开发中，递送系统的选择至关重要。目前，慢病毒载体因其可实现单次给药、靶向性强、免疫原性低且临床经验丰富，成为主流选择。然而，传统的慢病毒生产工艺面临滴度波动大、成本高、批次一致性差等挑战，难以满足体内治疗的大规模生产需求。
破解这一瓶颈的关键在于稳定细胞系的开发。以深研生物的EuLV稳转细胞系生产系统为例，通过使用可诱导的稳定生产细胞系，在化学成分确定的培养基中生产，实现了病毒产量提升近百倍、生产成本降低80%的巨大飞跃，为产业化奠定了坚实基础。
稳转细胞系构建通常分为三步：
构建包装细胞系：将慢病毒包装基因稳定插入宿主细胞基因组。
插入目标基因：将CAR基因稳定插入包装细胞系，筛选出高产、稳定的单克隆。
规模化生产：在化学成分限定培养基中进行高密度悬浮培养，诱导生产慢病毒载体。
图1：稳转细胞系构建路线图03 单细胞打印机：筛选高产细胞系的“神助攻”
在构建稳定细胞系的过程中，最关键的一步是筛选出高产、高稳定性的单克隆细胞。而单细胞打印技术正是在这一环节发挥着“神助攻”的关键作用。
这项技术已在产业界得到成功验证。例如，国际药企葛兰素史克（GSK）在其发表于《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》（2020）的研究中，详细阐述了如何利用Cytena单细胞打印机，高效构建用于慢病毒载体生产的稳转细胞系。
该研究通过单细胞打印筛选出的高产单克隆，在摇瓶规模下生产的未浓缩慢病毒载体功能性滴度即可稳定超过1×10⁷ TU/mL，与高效瞬时转染的产量相当（图2）。
图2：在摇瓶中通过瞬时转染和稳定生产细胞系获得慢病毒载体滴度图。各点表示9个摇瓶中每个的滴度更重要的是，这些由单克隆衍生的细胞系展现出卓越的遗传稳定性——在连续传代培养超过20个代次后，其载体滴度和整合的载体基因拷贝数均未发生显著衰减(图3）。
图3：克隆在超过20个细胞倍增的过程中，功能滴度（TU/mL）和物理滴度（p24）保持稳定。最终，该研究成功将筛选出的克隆放大至50升一次性搅拌罐生物反应器进行生产，单个批次即可收获高达2×10¹¹总功能性TU的慢病毒载体（图4），理论上足以满足10名患者的治疗需求。这一案例充分证明了基于单细胞打印的克隆筛选策略，是实现稳定、高产、可规模化慢病毒生产工艺的基石。
图4：48小时后收获50L批次的结果图。未浓缩载体的功能滴度范围为0.4 ~ 1.4 107 TUCEM/mL，感染性范围为7 ~ 43 TUCEM/pg p24。
单细胞打印技术的核心优势如下：
智能筛选
可设定细胞直径、圆度、荧光强度等多参数，真正筛选出“强壮合格”的细胞，提高单克隆形成率。
高效快速
分选一个96孔板仅需1-2分钟，单细胞率大于95%。
操作简便
设备无需复杂维护清洗，采用一次性无菌打印芯片，杜绝交叉污染。
精准定位
可调整液滴位置，确保液滴滴入孔板中央，细胞沉降到孔底后能轻松拍到Day0的单细胞图片，避免ghost well问题。
证据追溯
分选过程自动拍摄多张喷嘴图片，完整记录单克隆来源，满足监管机构对单克隆源性的严苛要求。
04 未来可期：技术融合加速CAR-T产业化
随着生物制药行业对细胞系单克隆性的要求日益严格，单细胞打印技术的重要性将愈发凸显。从GSK等企业的成功实践可以看出，单细胞打印技术是产业化工艺中确保克隆源性、合规性与一致性的关键环节。它与慢病毒生产技术的深度融合，正推动细胞治疗工艺向更高效、规范、可追溯的方向发展。未来，我们有望见证更多基于In Vivo CAR-T的治疗方案获批上市，为全球癌症患者带来新的希望。而单细胞打印技术，将继续作为幕后功臣，在这一进程中扮演不可或缺的角色。
参考资料：
- 2025 ASGCT | 易慕峰In Vivo体内CAR-T技术平台重磅亮相
- In Vivo与Allo CAR-T：谁先攻克商业化堡垒？
- 体内细胞疗法工艺新突破：EuLV稳转细胞系慢病毒载体系统高效突破LVV生产瓶颈
- Chen, Y.H., et al. (2020). Rapid Lentiviral Vector Producer Cell Line Generation Using a Single DNA Construct. Mol Ther Methods Clin Dev.
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