自由移动动物双光子成像：新型显微镜实时三维运动校正功能
2025-10-17 来源:本站 点击次数:74这项研究名为“Closed-loop two-photon functional imaging in a freely moving animal”，由Paul McNulty、Rui Wu、Akihiro Yamaguchi、Ellie S. Heckscher、Andrew Haas、Amajindi Nwankpa、Mirna Mihovilovic Skanata和Marc Gershow共同完成。该论文于2025年7月在《Nature Communications》期刊上在线发表。这项工作不仅解决了运动伪影的难题，还首次在自由爬行的果蝇幼虫中实现了细胞分辨率的功能成像，揭示了先前未知的神经行为关联。
重要发现
01CRASH2p显微镜的技术原理与实现
本研究核心贡献是开发了闭环谐振轴向扫描高速双光子（CRASH2p）显微镜，能够在自由移动动物中实现实时三维运动校正的体积功能成像。传统双光子显微镜对运动高度敏感，且需物理连接限制动物行为，而CRASH2p通过双扫描头设计（跟踪头和成像头）实现了无创成像。跟踪头使用1070纳米脉冲激光专用于跟踪单个参考神经元（通过钙不敏感红色荧光蛋白mCherry标记），通过圆柱形扫描和卡尔曼滤波实时估计神经元位置，并以亚毫秒延迟和亚微米精度反馈至成像系统。成像头则采用920纳米激光激发绿色钙指示剂（如GCaMP6f），并结合“Pong”扫描策略进行体积成像。Pong扫描通过三角波驱动x和y轴扫描器，替代传统光栅扫描，消除了慢轴问题，使采样更均匀分布，有助于校正旋转和变形。双色成像允许通过红色通道校正运动引起的荧光变化，确保绿色信号准确反映神经活动。
实验在自由爬行的果蝇幼虫中进行，幼虫在琼脂糖包被的盖玻片上爬行，显微镜通过实时跟踪参考神经元来稳定成像体积。研究重点关注了幼虫腹神经索（VNC）中的节段重复中间神经元，如A27h premotor神经元和Even-skipped+ lateral（EL）本体感觉神经元。通过双色标记（GCaMP6f/mCherry），CRASH2p记录了在前进和后退爬行期间的神经活动。成像数据经过多阶段配准管道处理：先校正刚性运动（旋转和平移），再通过B样条基自由形变校正非刚性变形，最后应用强度校正以消除空间不均一荧光变化。结果显示，在前进爬行时，A27h神经元的中央过程呈现后前传播的活动波，而在后退爬行时活动被抑制；相反，M神经元（与A27h形态相近）在后退爬行时表现活跃。这些发现通过主成分分析（PCA）进一步验证，显示活动波具有解剖特异性，且绿色荧光变化与行为同步，而红色通道无类似模式，排除了运动伪影。
03光学成像技术的优势与验证
CRASH2p的光学设计显著提升了成像性能。双光子激发减少了散射和脱靶荧光的影响，而闭环跟踪补偿了平移运动。Pong扫描策略通过高频采样（如400 kHz轴向线速率）实现了10 Hz体积成像速率，确保在毫米/秒级运动下保持微米级分辨率。此外，时间多路复用技术将跟踪和成像路径的红色光子分离，避免了串扰。实验还通过对照组（如GFP标记的幼虫）验证了信号特异性：在GCaMP标记的动物中，旅行波表示解释了大部分方差，而GFP对照组无此现象，证实了钙指示剂的动态响应。这些技术使得在自由行为中首次观察到EL神经元在前进爬行时的活动波，以及Mooncrawler Descending Neuron（MDN）在后退爬行时的活动增强，突出了细胞分辨率成像的重要性。
创新与亮点
01突破传统成像难题
CRASH2p显微镜突破了自由移动动物中双光子成像的长期难题。传统方法受限于运动伪影，尤其是昆虫等小动物，其大脑在行为中会发生剧烈变形。本研究通过实时闭环跟踪，无需植入标记物即可补偿三维平移，结合Pong扫描和非刚性配准，校正了旋转和变形，实现了在果蝇幼虫中的稳定体积成像。这解决了单光子成像中散射敏感和双光子成像中运动敏感的权衡问题，为研究自然行为下的神经电路提供了新途径。
技术亮点包括双扫描头设计、谐振TAG透镜轴向扫描和时间多路复用检测。Pong扫描作为关键创新，通过三角波驱动替代正弦Lissajous扫描，提高了采样均匀性，减少了运动失真。多阶段配准管道结合了刚性校正、B样条形变和强度平滑，确保荧光比率计量的准确性。这些技术使得成像速度达10 Hz体积速率，在200毫秒内完成200×200×50微米体积采样，同时保持细胞分辨率。此外，双色成像策略通过红色参考通道校正了光学路径变化，提升了信号可靠性。
03科学价值与应用前景
CRASH2p的价值体现在推动模型生物研究上。果蝇幼虫作为系统神经科学模型，具有遗传工具丰富、神经元可识别和全脑连接组图谱完整等优势，但此前难以在自由行为中记录活动。本研究不仅发现了A27h和M神经元在相反行为模式中的分工，还证实了EL神经元的本体感觉角色，为运动控制和本体感觉研究提供了新见解。技术通用性高，可扩展至其他小动物或厚组织成像，潜在应用包括行为神经科学、疾病模型和光学遗传学操纵。
总结与展望
CRASH2p显微镜的成功开发标志着自由移动动物中双光子功能成像的重大进步，通过实时运动校正和体积成像，实现了细胞分辨率的神经活动记录。这项技术不仅克服了传统成像的运动限制，还揭示了果蝇幼虫VNC中节段神经元的动态活动波，为理解行为控制的神经基础提供了新证据。未来，该技术可进一步优化，如集成旋转跟踪以提升校正能力，或结合高速成像技术（如FACED或LBM）实现更高帧率。此外，扩展至密集标记组织或其他模型生物将拓宽其在神经科学中的应用。总之，CRASH2p为研究自然行为下的全脑活动开辟了新道路，有望推动精准神经环路解析和行为学研究的发展。
声明：本文仅用作学术目的。
McNulty P, Wu R, Yamaguchi A, Heckscher ES, Haas A, Nwankpa A, Skanata MM, Gershow AM. Closed-loop two-photon functional imaging in a freely moving animal. Nat Commun. 2025 Jul 1;16(1):5950.
DOI:10.1038/s41467-025-60648-x.