4种细菌计数分光光度计法的建立及应用
2025-11-07 来源:本站 点击次数:88
引言
在禽类养殖中，细菌性疾病是较常见且危害大的一类疫病。细菌性疾病常见的种类有20多种，其中具有代表性的细菌有大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、葡萄球菌、副鸡嗜血杆菌等Ｗ。病原细菌的滋生和繁殖容易导致养殖动物的生长受阻、免疫力下降和疾病发生，对养殖业造成巨大的经济损失。实验室进行抗生素及替抗产品评估，均需要配制标准浓度的菌液，所以需要对细菌菌液的浓度进行测定。目前，细菌计数的常用方法有显微计数法、麦氏比浊法、质量测定法和平板计数法等。常见的麦氏比浊法操作简单，但容易受到操作者主观因素的影响，误差较大。显微镜计数法和平板计数法虽然结果相对于麦氏比浊法准确，但操作复杂、费时费力且重复性较差，对后续试验的实施有一定影响。
在一定的浓度范围内，菌悬液中的微生物细胞浓度与液体的吸光度成正比，与透光度成反比Ｍ。王晓旭等和董自艳等发现，不同细菌在一定浓度范围内，菌悬液浓度与吸光度呈良好的线性关系。因此，可以通过测定菌悬液吸光度来确定微生物细胞的浓度。本研究以大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、葡萄球菌为目标菌，对不同浓度的细菌悬液进行平板计数与吸光度值测定，分析二者之间线性关系，建立一种通过分光光度计对细菌进行计数的方法。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种 标准菌株：大肠埃希菌25922、葡萄球菌25923；实验室分离鉴定的菌株：沙门氏菌21106、鸭疫里默氏杆菌21119。
1.1.2试剂与仪器 LB液体培养基、营养琼脂培养基、胎牛血清、无菌PBS溶液；UV－1900型分光光度计、恒温振荡培养箱、CO2培养箱。
1.2方法
1.2.1菌液制备 从－80°Ｃ冰箱取出保存的菌株，在含有5％牛血清的营养琼脂板上进行划线复苏。待细菌过夜培养后，在无菌环境下，挑取纯化后的单菌落接种于10mL含5％牛血清的LB液体培养基中，摇床振荡培养12~18ｈ（37℃，200r/min），获得细菌原液。将原液进行2倍梯度稀释，共稀释6个梯度。
1.2.2吸光度测定 取3mL梯度稀释的菌液至比色皿中，在波长600ｎｍ处测定其吸光度值，尽可能保证其吸光度值在0.1~1.0之间，重复测定3次。
1.2.3平板计数 依次将不同浓度的菌悬液用液体培养基做10倍梯度稀释。分别取10-5~10-8稀释度的菌液各100µL点在营养琼脂平板中，摇匀并做好标记。过夜培养后，记录各平板上的菌落数，选取菌落数在30~300个之间的平板作为菌落总数测定的标准。
1.2.4标准曲线的建立 将不同浓度菌液测得的吸光度值作为横坐标，平板计数所得活菌数（*10-7CFU/mL）为纵坐标，建立标准曲线。
1.2.5标准曲线的应用 不同菌种各选取两株细菌，过夜培养后测定其吸光度值，然后通过平板菌落计数法测活菌浓度（步骤同1.2.3）。将测量所得吸光度值代人建立的标准曲线回归方程，将计算得到的结果与实际平板计数结果进行对比验证，计算其拟合程度。
2．结果
2.1细菌平板计数与吸光度值测定结果
将不同细菌不同稀释度的吸光度：值与细菌平板计数得到结果，进行统计分析。每种细菌统计三组数据，将三组数据分别与平板计数的结果进行拟定线性方程，选择线性关系较好的一组数据作为最终建立标准曲线的方程式。具体数据见表1。
2.2不同细菌的标准曲线的建立
根据对不同细菌菌悬液的吸光度值测定与平板计数(表1)，以测定所得吸光度值为横坐标，细菌平板计数结果(x10?CFU/mL)为纵坐标，建立不同细菌的细菌数与吸光度值之间相关线性关系的标准曲线，如图1~4.若建立的回归方程R2大于0.95，表明在此吸光度范围内细菌悬液的吸光度与细菌数量之间呈良好的线性关系
2.2.1大肠杆菌标准曲线 以大肠杆菌不同稀释度利用分光光度计测得的吸光度值为横坐标、活菌浓度为纵坐标建立大肠杆菌细菌数-吸光度标准曲线，其建立的回归方程为y=132.53x-0.6058(R2=0.9937)，呈现良好的线性关系(图1)。
2.2.2沙门氏菌标准曲线 以沙门氏菌不同稀释度利用分光光度计测得的吸光度值为横坐标、活菌浓度为纵坐标建立沙门氏菌细菌数-吸光度标准曲线，其建立的回归方程为y=190.23x+8.1172(R2=0.9989)，呈现良好的线性关系(图2)。
2.2.3葡萄球菌标准曲线 以葡萄球菌不同稀释度利用分光光度计测得的吸光度值为横坐标、活菌浓度为纵坐标建立葡萄球菌细菌数-吸光度标准曲线，其建立的回归方程为y=287.61x+12.764(R2-0.9943)，呈现良好的线性关系(图3)。
2.2.4鸭疫里默氏杆菌标准曲线 以鸭疫里默氏杆菌不同稀释度利用分光光度计测得的吸光度值为横坐标、活菌浓度为纵坐标建立鸭疫里默氏杆菌-吸光度标准曲线，其建立的回归方程为y=103.17x-5.0077(R2=0.9942)，呈现良好的线性关系(图4)。
2.3标准曲线的应用
不同菌种各选取两株细菌进行平板计数与吸光度值测定并计算其拟合程度，结果显示，大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌以及鸭疫里默氏杆菌菌悬液的实际细菌计数数值与曲线计算数值拟合程度均达到了90%以上，具有较高的可信度，推荐使用(表2)。
3.讨论与结论
实验室常规的细菌浓度检测，一般采用平板计数的方法，该方法是细菌的活菌计数法，使用中容易受操作者的熟练程度和细菌的不同生长周期影响，并且需要人员眼观计数，从而使计数的重复性差，并且操作过程费时费力。目前在实验室进行药物的最小抑菌浓度测定，药敏试验等试验需要快速细菌计数，因此，与传统计数方法相比，用细菌标准曲线进行细菌计数省时省力，操作便捷，重复性良好。细菌悬浮液的吸光度与菌液浓度之间呈正相关，通过测定菌液的吸光度，结合平板计数结果绘制出的标准曲线，可以相对准确快速地根据吸光度计算菌液浓度。在进行大量细菌的微量最小抑菌浓度的药敏实验时，可以根据所需的菌液浓度通过标准方程推出适合的吸光度，再根据所需吸光度对菌液进行稀释，在很大程度上增加了实验操作的便利性，也为实验结果的准确性提供了保证。
本研究细菌计数方法的建立，简便快捷，为实验室建立不同细菌的标准曲线方程提供了参考。
文章来源：[1]许明清,汪建华,王振,等.4种细菌计数分光光度计法的建立及应用[J].山东畜牧兽医,2024,45(06):8-10.
在禽类养殖中，细菌性疾病是较常见且危害大的一类疫病。细菌性疾病常见的种类有20多种，其中具有代表性的细菌有大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、葡萄球菌、副鸡嗜血杆菌等Ｗ。病原细菌的滋生和繁殖容易导致养殖动物的生长受阻、免疫力下降和疾病发生，对养殖业造成巨大的经济损失。实验室进行抗生素及替抗产品评估，均需要配制标准浓度的菌液，所以需要对细菌菌液的浓度进行测定。目前，细菌计数的常用方法有显微计数法、麦氏比浊法、质量测定法和平板计数法等。常见的麦氏比浊法操作简单，但容易受到操作者主观因素的影响，误差较大。显微镜计数法和平板计数法虽然结果相对于麦氏比浊法准确，但操作复杂、费时费力且重复性较差，对后续试验的实施有一定影响。
在一定的浓度范围内，菌悬液中的微生物细胞浓度与液体的吸光度成正比，与透光度成反比Ｍ。王晓旭等和董自艳等发现，不同细菌在一定浓度范围内，菌悬液浓度与吸光度呈良好的线性关系。因此，可以通过测定菌悬液吸光度来确定微生物细胞的浓度。本研究以大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、葡萄球菌为目标菌，对不同浓度的细菌悬液进行平板计数与吸光度值测定，分析二者之间线性关系，建立一种通过分光光度计对细菌进行计数的方法。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种 标准菌株：大肠埃希菌25922、葡萄球菌25923；实验室分离鉴定的菌株：沙门氏菌21106、鸭疫里默氏杆菌21119。
1.1.2试剂与仪器 LB液体培养基、营养琼脂培养基、胎牛血清、无菌PBS溶液；UV－1900型分光光度计、恒温振荡培养箱、CO2培养箱。
1.2方法
1.2.1菌液制备 从－80°Ｃ冰箱取出保存的菌株，在含有5％牛血清的营养琼脂板上进行划线复苏。待细菌过夜培养后，在无菌环境下，挑取纯化后的单菌落接种于10mL含5％牛血清的LB液体培养基中，摇床振荡培养12~18ｈ（37℃，200r/min），获得细菌原液。将原液进行2倍梯度稀释，共稀释6个梯度。
1.2.2吸光度测定 取3mL梯度稀释的菌液至比色皿中，在波长600ｎｍ处测定其吸光度值，尽可能保证其吸光度值在0.1~1.0之间，重复测定3次。
1.2.3平板计数 依次将不同浓度的菌悬液用液体培养基做10倍梯度稀释。分别取10-5~10-8稀释度的菌液各100µL点在营养琼脂平板中，摇匀并做好标记。过夜培养后，记录各平板上的菌落数，选取菌落数在30~300个之间的平板作为菌落总数测定的标准。
1.2.4标准曲线的建立 将不同浓度菌液测得的吸光度值作为横坐标，平板计数所得活菌数（*10-7CFU/mL）为纵坐标，建立标准曲线。
1.2.5标准曲线的应用 不同菌种各选取两株细菌，过夜培养后测定其吸光度值，然后通过平板菌落计数法测活菌浓度（步骤同1.2.3）。将测量所得吸光度值代人建立的标准曲线回归方程，将计算得到的结果与实际平板计数结果进行对比验证，计算其拟合程度。
2．结果
2.1细菌平板计数与吸光度值测定结果
将不同细菌不同稀释度的吸光度：值与细菌平板计数得到结果，进行统计分析。每种细菌统计三组数据，将三组数据分别与平板计数的结果进行拟定线性方程，选择线性关系较好的一组数据作为最终建立标准曲线的方程式。具体数据见表1。
2.2不同细菌的标准曲线的建立
根据对不同细菌菌悬液的吸光度值测定与平板计数(表1)，以测定所得吸光度值为横坐标，细菌平板计数结果(x10?CFU/mL)为纵坐标，建立不同细菌的细菌数与吸光度值之间相关线性关系的标准曲线，如图1~4.若建立的回归方程R2大于0.95，表明在此吸光度范围内细菌悬液的吸光度与细菌数量之间呈良好的线性关系
2.2.1大肠杆菌标准曲线 以大肠杆菌不同稀释度利用分光光度计测得的吸光度值为横坐标、活菌浓度为纵坐标建立大肠杆菌细菌数-吸光度标准曲线，其建立的回归方程为y=132.53x-0.6058(R2=0.9937)，呈现良好的线性关系(图1)。
2.2.2沙门氏菌标准曲线 以沙门氏菌不同稀释度利用分光光度计测得的吸光度值为横坐标、活菌浓度为纵坐标建立沙门氏菌细菌数-吸光度标准曲线，其建立的回归方程为y=190.23x+8.1172(R2=0.9989)，呈现良好的线性关系(图2)。
2.2.3葡萄球菌标准曲线 以葡萄球菌不同稀释度利用分光光度计测得的吸光度值为横坐标、活菌浓度为纵坐标建立葡萄球菌细菌数-吸光度标准曲线，其建立的回归方程为y=287.61x+12.764(R2-0.9943)，呈现良好的线性关系(图3)。
2.2.4鸭疫里默氏杆菌标准曲线 以鸭疫里默氏杆菌不同稀释度利用分光光度计测得的吸光度值为横坐标、活菌浓度为纵坐标建立鸭疫里默氏杆菌-吸光度标准曲线，其建立的回归方程为y=103.17x-5.0077(R2=0.9942)，呈现良好的线性关系(图4)。
2.3标准曲线的应用
不同菌种各选取两株细菌进行平板计数与吸光度值测定并计算其拟合程度，结果显示，大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌以及鸭疫里默氏杆菌菌悬液的实际细菌计数数值与曲线计算数值拟合程度均达到了90%以上，具有较高的可信度，推荐使用(表2)。
3.讨论与结论
实验室常规的细菌浓度检测，一般采用平板计数的方法，该方法是细菌的活菌计数法，使用中容易受操作者的熟练程度和细菌的不同生长周期影响，并且需要人员眼观计数，从而使计数的重复性差，并且操作过程费时费力。目前在实验室进行药物的最小抑菌浓度测定，药敏试验等试验需要快速细菌计数，因此，与传统计数方法相比，用细菌标准曲线进行细菌计数省时省力，操作便捷，重复性良好。细菌悬浮液的吸光度与菌液浓度之间呈正相关，通过测定菌液的吸光度，结合平板计数结果绘制出的标准曲线，可以相对准确快速地根据吸光度计算菌液浓度。在进行大量细菌的微量最小抑菌浓度的药敏实验时，可以根据所需的菌液浓度通过标准方程推出适合的吸光度，再根据所需吸光度对菌液进行稀释，在很大程度上增加了实验操作的便利性，也为实验结果的准确性提供了保证。
本研究细菌计数方法的建立，简便快捷，为实验室建立不同细菌的标准曲线方程提供了参考。
文章来源：[1]许明清,汪建华,王振,等.4种细菌计数分光光度计法的建立及应用[J].山东畜牧兽医,2024,45(06):8-10.
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