超分辨率显微镜技术近年来极大地推动了生物成像的发展，但如何在所有空间维度上实现各向同性的分辨率一直是一个重大挑战。传统方法往往需要复杂且高度敏感的光学系统，限制了其广泛应用。本研究提出了一种名为轴向干涉散斑照明结构光照明显微镜（AXIS-SIM）的新技术，它通过最小程度的硬件修改，利用简单背反射镜产生的构造干涉来增强轴向分辨率，无需额外的相位控制或复杂光束整形。AXIS-SIM不仅提供了优异的光学切片能力，还将轴向分辨率提升至140.1纳米，侧向分辨率达108.5纳米，实现了接近各向同性的超分辨率成像。此外，该技术对校准误差和样本诱导像差具有强鲁棒性，支持多种生物样本的高通量三维超分辨率成像。实验展示了其在细胞膜三维形态可视化、溶酶体和微管的纳米级分布解析以及溶酶体运动跟踪方面的潜力，为生物医学研究提供了实用工具。

本论文的重要发现者包括Hajun Yoo、Kwanhwi Ko、Sukhyeon Ka、Gwiyeong Moon、Hyunwoong Lee、Seongmin Im、Peng Xi & Donghyun Kim。他们共同发表的论文“Near-isotropic super-resolution microscopy with axial interference speckle illumination”于2025年10月在线发表在Nature Communications上。

重要发现
01技术原理与实验设计
AXIS-SIM的核心创新在于利用轴向干涉散斑照明来克服三维分辨率各向异性的难题。技术原理基于在宽场随机散斑照明显微镜基础上，引入一个银镜基底放置在样本台上，通过镜面反射产生干涉效应，从而在轴向方向压缩散斑点扩散函数。与传统随机散斑照明相比，AXIS照明通过构造干涉显著减少了散斑模式的轴向延伸，提升了光学切片能力。实验光学系统采用倒置显微镜框架，使用488纳米和633纳米激光源，通过旋转漫射器生成动态散斑图案，并由电动纳米台沿z轴进行序列扫描，以层析方式捕获三维图像。这种设计不仅简化了光学布局，还避免了复杂相位控制的需求。

通过有限差分时域模拟和实验验证，AXIS照明将轴向有效散斑点扩散函数的半高全宽从703.5纳米降至156.6纳米，提升超过四倍。这种轴向约束能力使荧光信号在焦平面方差增大，从而提高了深度分辨精度。实验中使用水介质和约100微米的镜面间隙来减少像差，并通过轴向畸变校正进一步优化成像质量。值得注意的是，AXIS-SIM对镜面倾斜具有鲁棒性，模拟显示即使镜面倾斜10度，轴向分辨率增强效果仍与完美对齐相当，这降低了实验设置的复杂性。

在生物成像方面，AXIS-SIM被用于活U2OS细胞微管和固定U-87 MG细胞膜蛋白的成像。对于活细胞，扫描间隔40纳米，通过磷酸盐缓冲盐水介质和畸变校正，AXIS-SIM提供了清晰的深度信息，优于三维Richardson-Lucy去卷积图像。微管结构在轴向视图上显示出更锐利的细节，表明显著的光学切片能力。对于厚固定细胞（约10微米），AXIS-SIM实现了近各向同性超分辨率，空间频率谱和解相关分析显示轴向空间频率提升超过五倍。此外，通过组合多个感兴趣区域和增大z扫描间隔（200纳米），AXIS-SIM支持大体积成像（86.0×53.2×11.7微米³），展示了高通量潜力。

在动态跟踪方面，AXIS-SIM能够捕获溶酶体的快速细胞内运动。通过时间序列成像，定量分析显示动态溶酶体的平均速度为79.38纳米/秒，其中一些溶酶体在18-24秒间短暂离焦后返回焦平面，体现了高时空分辨率。这种能力使得AXIS-SIM不仅能静态解析细胞器形态，还能跟踪动态过程，为细胞生物学研究提供新视角。

创新与亮点
01技术突破与成像难题解决
AXIS-SIM的核心突破在于解决了超分辨率显微镜中长期存在的三维分辨率各向异性问题。传统技术如STED或SIM往往在轴向分辨率上受限，导致结构细节在z轴模糊。AXIS-SIM通过轴向干涉散斑照明，将轴向分辨率提升至140.1纳米，侧向分辨率108.5纳米，分辨率各向同性比达1.29，接近理想各向同性。这一成就得益于简单的镜面干涉设计，无需复杂多物镜系统或精确相位控制，降低了光学复杂性。与需要数百帧图像的传统超分辨率光学波动成像相比，AXIS-SIM仅需50-100帧每层即可实现高质量重建，这归功于超分辨率自相关与两步去卷积方法的整合，减少了光漂白，适用于光敏感生物样本。

另一个大亮点是AXIS-SIM的鲁棒性。实验证明，它对镜面倾斜和样本诱导像差不敏感，支持高通量成像。这种稳定性使其在生物医学应用中更具实用性，例如在活细胞成像中跟踪细胞器运动，或在厚组织样本中解析精细结构。此外，技术兼容多色成像，银镜反射在可见光和近红外波段均匀，确保了多波长应用的一致性。

02光学生物医疗价值体现
在生物医疗领域，AXIS-SIM的价值体现在其能够提供高分辨率的三维细胞结构可视化，从而推动细胞生物学和疾病研究。例如，溶酶体作为细胞降解关键细胞器，其纳米级分布和运动模式通过AXIS-SIM被清晰解析，有助于理解溶酶体相关疾病机制。技术的高吞吐量特性支持大体积样本成像，如整个细胞或组织区域，为药物筛选和病理分析提供工具。

从光学工程角度看，AXIS-SIM的简化设计降低了成本和使用门槛，有望促进超分辨率显微镜在临床和基础研究中的普及。未来，结合深度学习重建或非线性荧光效应，可进一步优化分辨率各向同性，减少采集时间，最小化光毒性，拓展活体应用。

总结与展望
AXIS-SIM技术通过集成背反射镜和散斑照明，成功实现了近各向同性的超分辨率显微镜，在简化光学设置的同时提升了轴向分辨率。实验验证了其在活细胞和固定细胞成像中的高效性，支持多色和动态跟踪应用。