二甲双胍通过DNA甲基化和羟甲基化双向调控减轻肝损伤的保护机制
2025-11-14 来源:本站 点击次数:110
近日，郑州大学附属第一医院重症医学科刘峰宇博士和仝然博士为共同第一作者，孙同文教授为通讯作者，首次系统探讨了经典降糖药物二甲双胍（Metformin）对脓毒症相关肝损伤（Sepsis-associated liver injury, SLI）的保护作用及其表观遗传学机制。研究采用盲肠结扎穿孔术（CLP）诱导的SD脓毒症大鼠模型，结合RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）与oxRRBS（oxidative RRBS）甲基化测序技术，从全基因组层面揭示CLP诱导的SLI状态下肝脏组织DNA甲基化（5mC）和羟甲基化（5hmC）图谱的异常变化，并利用RNA-seq转录组分析验证二甲双胍通过双向调控DNMTs/TET2酶活性系统，逆转异常甲基化修饰，最终改善肝脏炎症与代谢功能障碍的分子机制。本研究鉴定出受甲基化修饰调控的A1cf和Atxn7l1两个关键差异表达基因，为脓毒症相关肝损伤的精准治疗提供了新的分子靶点和理论依据。相关研究成果以“Metformin attenuated sepsis-related liver injury by modulating the DNA methylation and hydroxymethylation landscape”为题发表于《International Immunopharmacology》期刊。
本研究通过RRBS和oxRRBS全面评估了肝组织中的全基因组DNA甲基化和羟甲基化模式。结果显示，盲肠结扎穿孔术（CLP）诱导的脓毒症相关肝损伤（SLI）与全基因组DNA低甲基化和高羟甲基化相关，二甲双胍干预后可以部分逆转上述表观遗传修饰改变。CLP组中DNA甲基转移酶（DNMTs）和TET2蛋白的表达水平上调，且受二甲双胍调控。另外，差异甲基化和羟甲基化基因的功能富集分析显示其主要参与氧化磷酸化和代谢通路。有趣的是，整合转录组数据成功鉴定出两个关键基因A1cf和Atxn7l1，其在CLP中表现为甲基化增加和表达下调，而这些改变可在二甲双胍干预后逆转。这些发现为SLI的表观遗传机制提供了新见解，并表明二甲双胍通过调控DNA甲基化和羟甲基化发挥肝脏保护作用。
研究要点
研究方法
动物模型构建：40只成年雄性SD大鼠，分为4组：假手术组（SC）、假手术+二甲双胍组（SC-MET）、CLP模型组（CLP）、CLP+二甲双胍组（CLP-MET）。CLP模型通过盲肠结扎穿孔术模拟脓毒症，二甲双胍（100 mg/kg）在术后1小时腹腔注射。
肝损伤与炎症指标检测：检测血清中ALT、AST、TNF-α、IL-6、IL-1β水平；肝组织H&E染色评估病理变化（如炎症浸润、出血）。
DNA甲基化与羟甲基化分析（RRBS+oxRRBS）：肝组织基因组DNA经MspI酶切后，分别进行RRBS和oxRRBS建库测序，鉴定差异甲基化区域（DMRs）和差异羟甲基化区域（DhMRs）。
功能注释：通过KEGG富集分析D(h)MRs相关基因的生物学通路。
转录组分析（RNA-seq）：提取肝组织总RNA，构建cDNA文库并测序，鉴定差异表达基因（DEGs），并进行KEGG通路富集。
多组学整合分析：交叉比对D(h)MRs与DEGs，筛选受甲基化/羟甲基化调控的关键基因（如A1CF、ATXN7L1），并通过Western blot验证蛋白表达。
结果图形
（1）二甲双胍进一步调控CLP引起的全局DNA甲基化/羟甲基化变化
通过RRBS和oxRRBS技术分析发现，CLP组大鼠肝组织表现出全局DNA高甲基化和高羟甲基化，而二甲双胍干预（CLP-MET组）显著降低甲基化水平并进一步升高羟甲基化。Western blot结果显示CLP组DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和TET2表达上调，二甲双胍逆转了DNMTs表达并进一步促进TET2表达。这表明二甲双胍通过调控甲基化酶和去甲基化酶活性，重建了SLI中的表观遗传谱。
（2）CLP与二甲双胍作用下差异（羟）甲基化修饰区域的基因注释
对启动子区域的D(h)MRs进行KEGG富集分析发现，CLP组的高甲基化DMRs主要富集于氧化磷酸化和代谢通路，而二甲双胍干预后，高甲基化DMRs转向富集于肾酸分泌和糖胺聚糖降解等通路。羟甲基化分析显示类似趋势，提示二甲双胍通过调节代谢相关基因的表观状态缓解肝损伤。
图3：DMR相关基因的KEGG通路分析。
（3）转录组分析揭示二甲双胍调控的表观遗传相关基因表达变化
RNA-seq结果显示，CLP组共有3307个DEGs，其中上调基因富集于TNF、NF-κB等炎症通路，下调基因富集于代谢通路。二甲双胍干预后，629个DEGs被逆转，上调基因转向代谢通路，下调基因涉及炎症通路，表明二甲双胍通过抑制炎症、促进代谢修复发挥保护作用。
（4）多组学整合鉴定脓毒症中受甲基化/羟甲基化异常调控的DEGs
通过交叉分析甲基化、羟甲基化和转录组数据，筛选出两个关键基因A1CF和ATXN7L1。CLP组中这两个基因启动子甲基化升高、表达下调，而二甲双胍逆转了这一趋势。Western blot验证其蛋白水平变化一致，提示A1CF和ATXN7L1两个关键基因可能是二甲双胍表观遗传调控的核心靶点。
结论和启示
本研究首次系统阐明了二甲双胍通过调节DNA甲基化/羟甲基化平衡缓解SLI的机制，其中主要聚焦其表观遗传调控功能，揭示其对DNMTs和TET2的双向调控作用。具体而言，二甲双胍通过逆转CLP诱导的DNA高甲基化、促进羟甲基化，调控关键基因（如A1CF、ATXN7L1）表达，最终减轻肝损伤。本研究局限性在于筛选的候选基因（A1CF、ATXN7L1）功能需进一步验证，且样本量较小。未来可扩大样本并开展功能实验，深化机制研究。
RRBS+oxRRBS技术在本研究中的核心作用
RRBS覆盖CpG富集区域，oxRRBS特异性识别5hmC，两者结合实现了全基因组范围内5mC和5hmC的精准定量，为甲基化/羟甲基化与转录组数据的整合提供关键数据，直接揭示表观遗传修饰与基因表达变化相关性。同时通过D(h)MRs富集分析揭示二甲双胍调控代谢和炎症通路的具体靶点，凸显其在表观遗传研究中的不可替代性。
RRBS+oxRRBS组合适用于疾病模型中的表观机制探索，尤其在代谢性疾病、炎症和药物干预研究中，可高效揭示环境-表观-基因互作网络。
参考文献：
Liu F, Tong R, Song H, Gong L, Ding X, Liu H, Li H, Liu L, Wang Y, Zhang R, Sun T. Metformin attenuated sepsis-related liver injury by modulating the DNA methylation and hydroxymethylation landscape. Int Immunopharmacol. 2025 May 7;157:114748.doi: 10.1016/j.intimp.2025.114748.
本研究通过RRBS和oxRRBS全面评估了肝组织中的全基因组DNA甲基化和羟甲基化模式。结果显示，盲肠结扎穿孔术（CLP）诱导的脓毒症相关肝损伤（SLI）与全基因组DNA低甲基化和高羟甲基化相关，二甲双胍干预后可以部分逆转上述表观遗传修饰改变。CLP组中DNA甲基转移酶（DNMTs）和TET2蛋白的表达水平上调，且受二甲双胍调控。另外，差异甲基化和羟甲基化基因的功能富集分析显示其主要参与氧化磷酸化和代谢通路。有趣的是，整合转录组数据成功鉴定出两个关键基因A1cf和Atxn7l1，其在CLP中表现为甲基化增加和表达下调，而这些改变可在二甲双胍干预后逆转。这些发现为SLI的表观遗传机制提供了新见解，并表明二甲双胍通过调控DNA甲基化和羟甲基化发挥肝脏保护作用。
研究要点
- 二甲双胍可能通过调控DNA甲基化和羟甲基化图谱在SLI中发挥肝脏保护作用。
- CLP诱导的SLI与全基因组DNA低甲基化和高羟甲基化相关。
- 二甲双胍治疗可部分逆转SLI中全基因组DNA甲基化和羟甲基化的变化。
- 差异甲基化和羟甲基化基因参与氧化磷酸化和代谢通路。
- 整合DNA甲基化、羟甲基化和转录组数据鉴定出A1CF和ATXN7L1为关键基因。
研究方法
动物模型构建：40只成年雄性SD大鼠，分为4组：假手术组（SC）、假手术+二甲双胍组（SC-MET）、CLP模型组（CLP）、CLP+二甲双胍组（CLP-MET）。CLP模型通过盲肠结扎穿孔术模拟脓毒症，二甲双胍（100 mg/kg）在术后1小时腹腔注射。
肝损伤与炎症指标检测：检测血清中ALT、AST、TNF-α、IL-6、IL-1β水平；肝组织H&E染色评估病理变化（如炎症浸润、出血）。
DNA甲基化与羟甲基化分析（RRBS+oxRRBS）：肝组织基因组DNA经MspI酶切后，分别进行RRBS和oxRRBS建库测序，鉴定差异甲基化区域（DMRs）和差异羟甲基化区域（DhMRs）。
功能注释：通过KEGG富集分析D(h)MRs相关基因的生物学通路。
转录组分析（RNA-seq）：提取肝组织总RNA，构建cDNA文库并测序，鉴定差异表达基因（DEGs），并进行KEGG通路富集。
多组学整合分析：交叉比对D(h)MRs与DEGs，筛选受甲基化/羟甲基化调控的关键基因（如A1CF、ATXN7L1），并通过Western blot验证蛋白表达。
结果图形
（1）二甲双胍进一步调控CLP引起的全局DNA甲基化/羟甲基化变化
通过RRBS和oxRRBS技术分析发现，CLP组大鼠肝组织表现出全局DNA高甲基化和高羟甲基化，而二甲双胍干预（CLP-MET组）显著降低甲基化水平并进一步升高羟甲基化。Western blot结果显示CLP组DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和TET2表达上调，二甲双胍逆转了DNMTs表达并进一步促进TET2表达。这表明二甲双胍通过调控甲基化酶和去甲基化酶活性，重建了SLI中的表观遗传谱。
表1：D(h)MR、hyper-D(h)MR 和 hypo-D(h)MR 数量
图1：二甲双胍在CLP相关SLI下调控DNA甲基化和羟甲基化谱。
图2：组间D(h)MR。
（2）CLP与二甲双胍作用下差异（羟）甲基化修饰区域的基因注释
对启动子区域的D(h)MRs进行KEGG富集分析发现，CLP组的高甲基化DMRs主要富集于氧化磷酸化和代谢通路，而二甲双胍干预后，高甲基化DMRs转向富集于肾酸分泌和糖胺聚糖降解等通路。羟甲基化分析显示类似趋势，提示二甲双胍通过调节代谢相关基因的表观状态缓解肝损伤。
图3：DMR相关基因的KEGG通路分析。
图4：DhMRs相关基因的KEGG通路分析。
（3）转录组分析揭示二甲双胍调控的表观遗传相关基因表达变化
RNA-seq结果显示，CLP组共有3307个DEGs，其中上调基因富集于TNF、NF-κB等炎症通路，下调基因富集于代谢通路。二甲双胍干预后，629个DEGs被逆转，上调基因转向代谢通路，下调基因涉及炎症通路，表明二甲双胍通过抑制炎症、促进代谢修复发挥保护作用。
图5：在RNA表达中检测到的基因。
（4）多组学整合鉴定脓毒症中受甲基化/羟甲基化异常调控的DEGs
通过交叉分析甲基化、羟甲基化和转录组数据，筛选出两个关键基因A1CF和ATXN7L1。CLP组中这两个基因启动子甲基化升高、表达下调，而二甲双胍逆转了这一趋势。Western blot验证其蛋白水平变化一致，提示A1CF和ATXN7L1两个关键基因可能是二甲双胍表观遗传调控的核心靶点。
图6：A1CF和ATXN7L1的表达。
结论和启示
本研究首次系统阐明了二甲双胍通过调节DNA甲基化/羟甲基化平衡缓解SLI的机制，其中主要聚焦其表观遗传调控功能，揭示其对DNMTs和TET2的双向调控作用。具体而言，二甲双胍通过逆转CLP诱导的DNA高甲基化、促进羟甲基化，调控关键基因（如A1CF、ATXN7L1）表达，最终减轻肝损伤。本研究局限性在于筛选的候选基因（A1CF、ATXN7L1）功能需进一步验证，且样本量较小。未来可扩大样本并开展功能实验，深化机制研究。
RRBS+oxRRBS技术在本研究中的核心作用
RRBS覆盖CpG富集区域，oxRRBS特异性识别5hmC，两者结合实现了全基因组范围内5mC和5hmC的精准定量，为甲基化/羟甲基化与转录组数据的整合提供关键数据，直接揭示表观遗传修饰与基因表达变化相关性。同时通过D(h)MRs富集分析揭示二甲双胍调控代谢和炎症通路的具体靶点，凸显其在表观遗传研究中的不可替代性。
RRBS+oxRRBS组合适用于疾病模型中的表观机制探索，尤其在代谢性疾病、炎症和药物干预研究中，可高效揭示环境-表观-基因互作网络。
参考文献：
Liu F, Tong R, Song H, Gong L, Ding X, Liu H, Li H, Liu L, Wang Y, Zhang R, Sun T. Metformin attenuated sepsis-related liver injury by modulating the DNA methylation and hydroxymethylation landscape. Int Immunopharmacol. 2025 May 7;157:114748.doi: 10.1016/j.intimp.2025.114748.
相关文章
更多 >