双抗体夹心法ELISA的通用操作步骤及注意事项
2025-11-19 来源:本站 点击次数:394
ELISA（酶联免疫吸附测定）试剂盒的检测操作需要严格按照标准流程进行，以确保结果的准确性和可靠性。以下是基于双抗体夹心法ELISA的通用操作步骤及注意事项。
一、实验前准备
1、试剂平衡：将试剂盒从冰箱取出，置于室温平衡30分钟，避免冷凝水影响反应。
2、样本处理：
血清样本需室温静置2小时或4℃过夜后离心（1000×g，20分钟），取上清检测。
避免反复冻融，长期保存建议分装后-20℃或-80℃存放。
标准品稀释：按说明书梯度稀释标准品，通常设置7个浓度梯度（如S1-S7）和1个空白对照（Blank）。
二、检测步骤
1、加样：
在微孔板中依次加入标准品、待测样本和空白对照，每孔100μL。
使用排枪或移液器确保加样精准，避免交叉污染。
2、孵育：
封板膜密封后，37℃孵育60-90分钟（具体时间参考说明书）。
3、洗涤：
孵育后倒尽孔内液体，加入洗涤液（如PBST）浸泡30秒，重复洗涤3-5次，拍干残留液体。
4、加酶标二抗：
每孔加入酶标记抗体（如HRP标记二抗），37℃孵育30-60分钟。
5、显色与终止：
加入底物溶液（如TMB），避光孵育10-20分钟，待孔内显蓝色后加入终止液（如2M H₂SO₄），颜色由蓝变黄。
6、读数：5分钟内用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），根据标准曲线计算样本浓度。
三、注意事项
1、操作规范：
加样后及时放入孵箱，避免人为延长孵育时间导致非特异性结合。
洗涤时需彻底，防止孔口残留酶影响结果。
2、质控要求：
设置双孔实验以提高数据准确性，空白调零孔用于校准OD值。
标准曲线R²值应≥0.99，批内变异系数需<10%。
3、试剂保存：
未使用的酶标板或试剂需2-8℃密封保存，避免反复冻融。
四、常见问题解决
高背景：可能因洗涤不充分或封闭不足，需增加洗涤次数或延长封闭时间。
显色过浅：检查酶标抗体是否失活，或延长底物反应时间。
实验成功建议
复孔设置：每个样本（含标准品）做2-3个复孔，计算平均值以降低操作误差。
避免污染：使用一次性枪头，操作时保持环境清洁，防止唾液或异物落入反应孔。
结果验证：通过回收率（80%-120%）和批内/批间差（<15%）评估试剂盒稳定性。
一、实验前准备
1、试剂平衡：将试剂盒从冰箱取出，置于室温平衡30分钟，避免冷凝水影响反应。
2、样本处理：
血清样本需室温静置2小时或4℃过夜后离心（1000×g，20分钟），取上清检测。
避免反复冻融，长期保存建议分装后-20℃或-80℃存放。
标准品稀释：按说明书梯度稀释标准品，通常设置7个浓度梯度（如S1-S7）和1个空白对照（Blank）。
二、检测步骤
1、加样：
在微孔板中依次加入标准品、待测样本和空白对照，每孔100μL。
使用排枪或移液器确保加样精准，避免交叉污染。
2、孵育：
封板膜密封后，37℃孵育60-90分钟（具体时间参考说明书）。
3、洗涤：
孵育后倒尽孔内液体，加入洗涤液（如PBST）浸泡30秒，重复洗涤3-5次，拍干残留液体。
4、加酶标二抗：
每孔加入酶标记抗体（如HRP标记二抗），37℃孵育30-60分钟。
5、显色与终止：
加入底物溶液（如TMB），避光孵育10-20分钟，待孔内显蓝色后加入终止液（如2M H₂SO₄），颜色由蓝变黄。
6、读数：5分钟内用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），根据标准曲线计算样本浓度。
三、注意事项
1、操作规范：
加样后及时放入孵箱，避免人为延长孵育时间导致非特异性结合。
洗涤时需彻底，防止孔口残留酶影响结果。
2、质控要求：
设置双孔实验以提高数据准确性，空白调零孔用于校准OD值。
标准曲线R²值应≥0.99，批内变异系数需<10%。
3、试剂保存：
未使用的酶标板或试剂需2-8℃密封保存，避免反复冻融。
四、常见问题解决
高背景：可能因洗涤不充分或封闭不足，需增加洗涤次数或延长封闭时间。
显色过浅：检查酶标抗体是否失活，或延长底物反应时间。
实验成功建议
复孔设置：每个样本（含标准品）做2-3个复孔，计算平均值以降低操作误差。
避免污染：使用一次性枪头，操作时保持环境清洁，防止唾液或异物落入反应孔。
结果验证：通过回收率（80%-120%）和批内/批间差（<15%）评估试剂盒稳定性。
相关文章
更多 >