人eEF2 ELISA试剂盒操作步骤详解
2026-03-26 来源:本站 点击次数:118
人真核细胞延伸因子2（eEF2）酶联免疫试剂盒的操作流程主要包括样本准备、加样孵育、洗涤、显色与读数等关键步骤，标准检测时长约为3–4小时，推荐采用双抗体夹心法以确保高灵敏度和重复性。
一、操作前准备事项
试剂与设备检查
确保试剂盒各组分齐全：预包被微孔板、标准品、酶标二抗、显色剂（A/B）、终止液、洗涤液、样本稀释液等。
所有试剂使用前需在室温（18–25℃）平衡30分钟，避免冷凝影响反应效率。
酶标仪预热30分钟，校准至主波长450 nm（参考波长630 nm）。
样本处理
血清/血浆：3000 rpm离心10分钟，取上清避免溶血或脂浊干扰。
细胞上清：离心去除细胞碎片，-80℃保存样本避免反复冻融。
组织匀浆：用PBS充分研磨后离心（10000 rpm, 10 min），取上清检测。
洗涤液配制
按说明书比例稀释浓缩洗涤液（如20倍浓缩液加蒸馏水稀释20倍），可水浴加热助溶结晶。
二、标准操作步骤（以双抗体夹心法为例）
加样设置
设立空白孔（不加样品和酶标试剂）、标准品孔（6–8个梯度浓度）、待测样本孔。
每孔加入50 μL标准品或样本，建议设置双复孔或三复孔提升数据可靠性。
第一次温育
用封板膜密封微孔板，37℃温育60分钟，使抗原充分结合固相抗体。
洗涤
小心揭去封板膜，弃去孔内液体，每孔加满洗涤液，静置30秒后甩干，重复5次，拍干避免交叉污染。
加酶标二抗
每孔加入100 μL酶标二抗（空白孔除外），37℃避光温育60分钟。
再次洗涤
同上步骤，彻底清洗未结合的酶标物。
显色反应
每孔先加显色剂A 50 μL，再加显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15–30分钟（根据颜色变化调整）。
终止反应
每孔加入50 μL终止液（溶液由蓝变黄），终止酶促反应。
读数分析
在加终止液后15分钟内完成OD值测定，使用450 nm波长读取吸光度。
采用四参数逻辑拟合（4-PL） 拟合标准曲线，反算样本浓度，避免线性回归带来的低浓度区偏差。
一、操作前准备事项
试剂与设备检查
确保试剂盒各组分齐全：预包被微孔板、标准品、酶标二抗、显色剂（A/B）、终止液、洗涤液、样本稀释液等。
所有试剂使用前需在室温（18–25℃）平衡30分钟，避免冷凝影响反应效率。
酶标仪预热30分钟，校准至主波长450 nm（参考波长630 nm）。
样本处理
血清/血浆：3000 rpm离心10分钟，取上清避免溶血或脂浊干扰。
细胞上清：离心去除细胞碎片，-80℃保存样本避免反复冻融。
组织匀浆：用PBS充分研磨后离心（10000 rpm, 10 min），取上清检测。
洗涤液配制
按说明书比例稀释浓缩洗涤液（如20倍浓缩液加蒸馏水稀释20倍），可水浴加热助溶结晶。
二、标准操作步骤（以双抗体夹心法为例）
加样设置
设立空白孔（不加样品和酶标试剂）、标准品孔（6–8个梯度浓度）、待测样本孔。
每孔加入50 μL标准品或样本，建议设置双复孔或三复孔提升数据可靠性。
第一次温育
用封板膜密封微孔板，37℃温育60分钟，使抗原充分结合固相抗体。
洗涤
小心揭去封板膜，弃去孔内液体，每孔加满洗涤液，静置30秒后甩干，重复5次，拍干避免交叉污染。
加酶标二抗
每孔加入100 μL酶标二抗（空白孔除外），37℃避光温育60分钟。
再次洗涤
同上步骤，彻底清洗未结合的酶标物。
显色反应
每孔先加显色剂A 50 μL，再加显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15–30分钟（根据颜色变化调整）。
终止反应
每孔加入50 μL终止液（溶液由蓝变黄），终止酶促反应。
读数分析
在加终止液后15分钟内完成OD值测定，使用450 nm波长读取吸光度。
采用四参数逻辑拟合（4-PL） 拟合标准曲线，反算样本浓度，避免线性回归带来的低浓度区偏差。
相关文章
更多 >