北京元森凯德气管肺递送装置流感病毒小鼠肺炎模型
2025-11-22 来源:本站 点击次数:117
一、实验目的
利用北京元森凯德（YSKD）研制生产的小动物气管肺递送装置，通过气溶胶气管内接种方式构建流感病毒小鼠肺炎模型[Influenza virus aerosolization was accomplished with YSKD Biotech MicroSprayer ]，并与传统鼻腔接种法进行对比，明确该装置在模型构建中的优势，建立标准化、高效且能模拟严重肺炎病理特征的实验方案，为流感病毒致病性研究、抗病毒药物筛选及疫苗评价提供可靠的动物模型支撑。
二、实验原理
北京元森凯德（YSKD）气管肺递送装置可将流感病毒溶液雾化为特定粒径的气溶胶颗粒，通过精准靶向小鼠气管及肺部，实现病毒的高效、均匀递送。该方式能模拟人类流感病毒自然吸入感染途径，且相较于鼻腔接种，可使病毒直接作用于肺部靶器官，充分利用肺部丰富的唾液酸受体（如α2,3-连接唾液酸受体），引发更接近临床严重肺炎的病理反应，包括更高的病毒载量、更显著的肺部损伤及强烈的炎症应答。
三、实验材料与仪器
（一）实验动物
8周龄雌性C57BL/6J小鼠，体重18-22g，饲养于SPF级环境，自由摄食饮水，适应环境3天后进行实验。实验经动物伦理委员会批准。
（二）病毒株
鼠适应型流感病毒A/Puerto Rico/8/34（H1N1，PR8株），经鸡胚培养扩增后，收集含病毒的尿囊液，分装并于-80℃冻存备用。使用前经MDCK细胞进行空斑试验测定病毒滴度（PFU/mL）。
（三）主要试剂及主要实验仪器
麻醉剂：1%戊巴比妥钠溶液（现配现用）；
染色剂：台盼蓝（Trypan Blue）、花青染料（Cy7.5）；
基础培养基：DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）；
核酸提取试剂：PureLink™ RNA Mini Kit（Thermo Fisher）；
ELISA试剂盒：小鼠IL-6、IL-1β、IL-17A、MPO、ICAM-1检测试剂盒（Solarbio）；
组织固定液：4%多聚甲醛溶液；其他：PBS缓冲液、0.22μm滤膜、TPCK胰蛋白酶等。
核心装置：北京元森凯德（YSKD）研制生产的小动物气管肺递送装置（含YSKD Biotech MicroSprayer 雾化针、可视化小动物喉镜、固定台组件）；
四、实验步骤
（一）实验分组
将C57BL/6J小鼠随机分为2组，每组根据病毒剂量再设亚组（4.6 PFU、83.8 PFU、420 PFU、1790 PFU），每组5只/时间点，另设PBS对照组：实验组：气溶胶气管内接种组（i.t.组），使用北京元森凯德（YSKD）气管肺递送装置接种；对照组：传统鼻腔接种组（i.n.组），采用移液器滴鼻接种。病毒气溶胶制备：取出冻存的PR8病毒液，于冰上解冻，用DMEM培养基稀释至所需浓度（4.6-1790 PFU/50μL）；将稀释后的病毒液加入北京元森凯德（YSKD）雾化器中，设置雾化参数；
（二）接种操作
1. 气溶胶气管内接种（i.t.组）
小鼠麻醉：腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（50μL/10g体重），待小鼠角膜反射消失后固定于手术台；气道暴露：将北京元森凯德（YSKD）小动物可视化喉镜插入小鼠口腔深部，暴露声带；精准接种：将北京元森凯德（YSKD）气管肺递送装置的雾化针插入气管，快速推送50μL病毒气溶胶溶液，确保气溶胶直接进入肺部；术后护理：接种后将小鼠直立放置，待苏醒后放回饲养笼，观察2h确认无异常。
2. 传统鼻腔接种（i.n.组）
小鼠轻度麻醉后，固定头部呈仰卧位；用移液器吸取50μL病毒液，缓慢滴入小鼠单侧鼻孔，待液体完全吸入后再滴入另一侧，避免呛咳。
（三）接种效果验证（可选，染色追踪）
取部分小鼠，分别采用台盼蓝和Cy7.5进行接种：台盼蓝验证：i.t.组和i.n.组分别接种50μL台盼蓝溶液，接种后立即处死小鼠，解剖取肺，观察肺组织染色分布；
Cy7.5荧光验证：接种后将小鼠置于IVIS成像系统中，设置激发波长770nm、发射波长820nm，进行活体成像；处死小鼠后取肺组织，进行离体成像，分析荧光强度和分布范围。
（四）样本采集
分别在接种后1天、3天、5天（dpi）采集样本：生存与体重监测：每日记录小鼠存活情况，测量体重变化，当体重下降超过25%时人道处死；
组织样本采集：
肺组织：处死小鼠后，迅速分离左肺（用于病理检测）和右肺（用于病毒载量、转录组分析）；右肺置于1mL DMEM培养基中，冰上研磨后离心（12000rpm，10min），取上清过0.22μm滤膜，备用；
支气管肺泡灌洗液（BALF）：向气管内注入800μL PBS，反复灌洗3次，收集灌洗液，4℃离心（3000g，10min），取上清用于ELISA检测。
（五）各项指标检测
1. 病毒载量与滴度检测
病毒载量（Q-PCR）：采用PureLink™ RNA Mini Kit提取肺组织上清总RNA，以100ng核酸为模板，使用NP基因特异性引物（NP-forward：5'-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3'；NP-reverse：5'-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3'）进行RT-qPCR检测；
病毒滴度（空斑试验）：将肺组织上清进行10倍梯度稀释，接种于MDCK细胞单层，培养48h后，计数空斑数，计算PFU/mL。
2. 病理组织学检测
左肺组织置于4%多聚甲醛中固定24h，常规脱水、石蜡包埋、切片（5μm）；进行HE染色，光学显微镜下观察肺泡壁增厚、炎症细胞浸润、血管水肿、出血等病理变化；采用4分制评分标准进行病理评分：0分（无病变）、1分（轻微病变）、2分（中度病变）、3分（重度病变）、4分（极重度病变）。
3. 肺湿/干比测定
取右肺部分组织，用滤纸吸干表面水分，称取湿重（W）；80℃烘箱中烘干48h，称取干重（D）；计算湿/干比（W/D），评估肺水肿程度。
4. 炎症因子检测
采用ELISA试剂盒检测BALF中IL-6、IL-1β、IL-17A、MPO、ICAM-1的浓度，严格按照试剂盒说明书操作，酶标仪读取OD值，计算浓度。
5. 转录组分析（5dpi样本）
采用TRIzol试剂提取肺组织总RNA，DNase I消化去除DNA；检测RNA纯度（A260/A280=1.8-2.0）和完整性（1.5%琼脂糖凝胶电泳）；取2μg合格RNA，使用KCTM Stranded mRNA Library Prep Kit构建测序文库，富集200-500bps PCR产物；采用DNBSEQ-T7测序仪进行PE150测序，对测序数据进行差异表达基因（DEGs）筛选、GO和KEGG通路富集分析。
五、数据记录与统计分析
记录各组小鼠生存曲线、体重变化率、病毒载量、病理评分、炎症因子浓度等数据；
采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析：生存曲线用log-rank检验，多时间点两组比较用ANOVA，两组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
六、模型评价标准
接种效率：i.t.组肺组织病毒载量和滴度显著高于i.n.组（P<0.05），Cy7.5荧光强度和分布范围更广泛；
病理特征：i.t.组肺组织病理评分、湿/干比显著高于i.n.组，呈现更严重的肺泡壁增厚、炎症浸润和肺水肿；
炎症应答：i.t.组BALF中IL-6、IL-1β、IL-17A、MPO、ICAM-1浓度显著升高，转录组分析显示炎症通路（NOD样受体通路、JAK-STAT通路等）显著富集；
疾病严重程度：i.t.组小鼠体重下降更快、死亡率更高（83.8 PFU和420 PFU剂量下死亡率达100%），更符合严重肺炎模型特征。
七、展望
北京元森凯德（YSKD）研制生产的小动物气管肺递送装置、YSKD Biotech小动物雾化给药仪等动物吸入雾化装置凭借精准靶向优势，已成为呼吸道疾病模型构建的核心工具，未来发展潜力广阔。技术层面，可融合智能控制系统，实现雾化粒径、剂量的实时调节与精准反馈，适配不同品系、体重的实验动物，进一步提升操作标准化。应用场景上，除流感病毒模型外，还可拓展至新冠病毒、呼吸道合胞病毒等多种病原体研究，以及慢阻肺、肺纤维化等慢性肺病的药物递送实验。
同时，结合影像技术实现给药过程与肺部沉积的动态可视化，将为药代动力学研究提供更直观的数据支撑。随着生物医药领域的发展，该装置有望成为连接基础研究与临床转化的关键平台，推动抗病毒药物与疫苗研发效率的大幅提升。
参考文献：
部分用户案例：哈佛大学，麻省理工学院，新加坡国立大学，瑞士苏黎世联邦理工学院，中国科学院上海药物研究所，中国中医科学院中药研究所，丽珠医药集团股份有限公司，康龙化成（宁波）生物医药有限公司，中日医院呼吸病学研究中心/中日友好临床医学研究所，北京中医药大学，中国药科大学，沈阳药科大学，复旦大学，浙江大学，四川大学，中南大学湘雅医学院等
24h技术服务和销售热线：17810632981 （手机号码同微信号）
公司官网：www.yskdbt.com
利用北京元森凯德（YSKD）研制生产的小动物气管肺递送装置，通过气溶胶气管内接种方式构建流感病毒小鼠肺炎模型[Influenza virus aerosolization was accomplished with YSKD Biotech MicroSprayer ]，并与传统鼻腔接种法进行对比，明确该装置在模型构建中的优势，建立标准化、高效且能模拟严重肺炎病理特征的实验方案，为流感病毒致病性研究、抗病毒药物筛选及疫苗评价提供可靠的动物模型支撑。
二、实验原理
北京元森凯德（YSKD）气管肺递送装置可将流感病毒溶液雾化为特定粒径的气溶胶颗粒，通过精准靶向小鼠气管及肺部，实现病毒的高效、均匀递送。该方式能模拟人类流感病毒自然吸入感染途径，且相较于鼻腔接种，可使病毒直接作用于肺部靶器官，充分利用肺部丰富的唾液酸受体（如α2,3-连接唾液酸受体），引发更接近临床严重肺炎的病理反应，包括更高的病毒载量、更显著的肺部损伤及强烈的炎症应答。
三、实验材料与仪器
（一）实验动物
8周龄雌性C57BL/6J小鼠，体重18-22g，饲养于SPF级环境，自由摄食饮水，适应环境3天后进行实验。实验经动物伦理委员会批准。
（二）病毒株
鼠适应型流感病毒A/Puerto Rico/8/34（H1N1，PR8株），经鸡胚培养扩增后，收集含病毒的尿囊液，分装并于-80℃冻存备用。使用前经MDCK细胞进行空斑试验测定病毒滴度（PFU/mL）。
（三）主要试剂及主要实验仪器
麻醉剂：1%戊巴比妥钠溶液（现配现用）；
染色剂：台盼蓝（Trypan Blue）、花青染料（Cy7.5）；
基础培养基：DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）；
核酸提取试剂：PureLink™ RNA Mini Kit（Thermo Fisher）；
ELISA试剂盒：小鼠IL-6、IL-1β、IL-17A、MPO、ICAM-1检测试剂盒（Solarbio）；
组织固定液：4%多聚甲醛溶液；其他：PBS缓冲液、0.22μm滤膜、TPCK胰蛋白酶等。
核心装置：北京元森凯德（YSKD）研制生产的小动物气管肺递送装置（含YSKD Biotech MicroSprayer 雾化针、可视化小动物喉镜、固定台组件）；
四、实验步骤
（一）实验分组
将C57BL/6J小鼠随机分为2组，每组根据病毒剂量再设亚组（4.6 PFU、83.8 PFU、420 PFU、1790 PFU），每组5只/时间点，另设PBS对照组：实验组：气溶胶气管内接种组（i.t.组），使用北京元森凯德（YSKD）气管肺递送装置接种；对照组：传统鼻腔接种组（i.n.组），采用移液器滴鼻接种。病毒气溶胶制备：取出冻存的PR8病毒液，于冰上解冻，用DMEM培养基稀释至所需浓度（4.6-1790 PFU/50μL）；将稀释后的病毒液加入北京元森凯德（YSKD）雾化器中，设置雾化参数；
（二）接种操作
1. 气溶胶气管内接种（i.t.组）
小鼠麻醉：腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（50μL/10g体重），待小鼠角膜反射消失后固定于手术台；气道暴露：将北京元森凯德（YSKD）小动物可视化喉镜插入小鼠口腔深部，暴露声带；精准接种：将北京元森凯德（YSKD）气管肺递送装置的雾化针插入气管，快速推送50μL病毒气溶胶溶液，确保气溶胶直接进入肺部；术后护理：接种后将小鼠直立放置，待苏醒后放回饲养笼，观察2h确认无异常。
2. 传统鼻腔接种（i.n.组）
小鼠轻度麻醉后，固定头部呈仰卧位；用移液器吸取50μL病毒液，缓慢滴入小鼠单侧鼻孔，待液体完全吸入后再滴入另一侧，避免呛咳。
（三）接种效果验证（可选，染色追踪）
取部分小鼠，分别采用台盼蓝和Cy7.5进行接种：台盼蓝验证：i.t.组和i.n.组分别接种50μL台盼蓝溶液，接种后立即处死小鼠，解剖取肺，观察肺组织染色分布；
Cy7.5荧光验证：接种后将小鼠置于IVIS成像系统中，设置激发波长770nm、发射波长820nm，进行活体成像；处死小鼠后取肺组织，进行离体成像，分析荧光强度和分布范围。
（四）样本采集
分别在接种后1天、3天、5天（dpi）采集样本：生存与体重监测：每日记录小鼠存活情况，测量体重变化，当体重下降超过25%时人道处死；
组织样本采集：
肺组织：处死小鼠后，迅速分离左肺（用于病理检测）和右肺（用于病毒载量、转录组分析）；右肺置于1mL DMEM培养基中，冰上研磨后离心（12000rpm，10min），取上清过0.22μm滤膜，备用；
支气管肺泡灌洗液（BALF）：向气管内注入800μL PBS，反复灌洗3次，收集灌洗液，4℃离心（3000g，10min），取上清用于ELISA检测。
（五）各项指标检测
1. 病毒载量与滴度检测
病毒载量（Q-PCR）：采用PureLink™ RNA Mini Kit提取肺组织上清总RNA，以100ng核酸为模板，使用NP基因特异性引物（NP-forward：5'-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3'；NP-reverse：5'-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3'）进行RT-qPCR检测；
病毒滴度（空斑试验）：将肺组织上清进行10倍梯度稀释，接种于MDCK细胞单层，培养48h后，计数空斑数，计算PFU/mL。
2. 病理组织学检测
左肺组织置于4%多聚甲醛中固定24h，常规脱水、石蜡包埋、切片（5μm）；进行HE染色，光学显微镜下观察肺泡壁增厚、炎症细胞浸润、血管水肿、出血等病理变化；采用4分制评分标准进行病理评分：0分（无病变）、1分（轻微病变）、2分（中度病变）、3分（重度病变）、4分（极重度病变）。
3. 肺湿/干比测定
取右肺部分组织，用滤纸吸干表面水分，称取湿重（W）；80℃烘箱中烘干48h，称取干重（D）；计算湿/干比（W/D），评估肺水肿程度。
4. 炎症因子检测
采用ELISA试剂盒检测BALF中IL-6、IL-1β、IL-17A、MPO、ICAM-1的浓度，严格按照试剂盒说明书操作，酶标仪读取OD值，计算浓度。
5. 转录组分析（5dpi样本）
采用TRIzol试剂提取肺组织总RNA，DNase I消化去除DNA；检测RNA纯度（A260/A280=1.8-2.0）和完整性（1.5%琼脂糖凝胶电泳）；取2μg合格RNA，使用KCTM Stranded mRNA Library Prep Kit构建测序文库，富集200-500bps PCR产物；采用DNBSEQ-T7测序仪进行PE150测序，对测序数据进行差异表达基因（DEGs）筛选、GO和KEGG通路富集分析。
五、数据记录与统计分析
记录各组小鼠生存曲线、体重变化率、病毒载量、病理评分、炎症因子浓度等数据；
采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析：生存曲线用log-rank检验，多时间点两组比较用ANOVA，两组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
六、模型评价标准
接种效率：i.t.组肺组织病毒载量和滴度显著高于i.n.组（P<0.05），Cy7.5荧光强度和分布范围更广泛；
病理特征：i.t.组肺组织病理评分、湿/干比显著高于i.n.组，呈现更严重的肺泡壁增厚、炎症浸润和肺水肿；
炎症应答：i.t.组BALF中IL-6、IL-1β、IL-17A、MPO、ICAM-1浓度显著升高，转录组分析显示炎症通路（NOD样受体通路、JAK-STAT通路等）显著富集；
疾病严重程度：i.t.组小鼠体重下降更快、死亡率更高（83.8 PFU和420 PFU剂量下死亡率达100%），更符合严重肺炎模型特征。
七、展望
北京元森凯德（YSKD）研制生产的小动物气管肺递送装置、YSKD Biotech小动物雾化给药仪等动物吸入雾化装置凭借精准靶向优势，已成为呼吸道疾病模型构建的核心工具，未来发展潜力广阔。技术层面，可融合智能控制系统，实现雾化粒径、剂量的实时调节与精准反馈，适配不同品系、体重的实验动物，进一步提升操作标准化。应用场景上，除流感病毒模型外，还可拓展至新冠病毒、呼吸道合胞病毒等多种病原体研究，以及慢阻肺、肺纤维化等慢性肺病的药物递送实验。
同时，结合影像技术实现给药过程与肺部沉积的动态可视化，将为药代动力学研究提供更直观的数据支撑。随着生物医药领域的发展，该装置有望成为连接基础研究与临床转化的关键平台，推动抗病毒药物与疫苗研发效率的大幅提升。
参考文献：
- Tetrahedral Framework Nucleic Acids Delivery of Pirfenidone for Anti-Inflammatory and Antioxidative Effects to Treat Idiopathic Pulmonary Fibrosis
- Active-Ingredient Screening and Synergistic Action Mechanism of Shegan Mixture for Anti-Asthma Effects Based on Network Pharmacology in a Mouse Model of Asthma
- Biological Hyperthermia-Inducing Nanoparticles for Specific Remodeling of the Extracellular Matrix Microenvironment Enhance Pro-Apoptotic Therapy in Fibrosis
- Inhaled immunoantimicrobials for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease
- Environmental factors ultraviolet a and ozone exacerbate the repeated inhalation toxicity of 6PPD in mice via accelerating the aging reaction
- ITGAM macrophage modulation as a potential strategy for treating neutrophilic Asthma: insights from bioinformatics analysis and in vivo experiments
部分用户案例：哈佛大学，麻省理工学院，新加坡国立大学，瑞士苏黎世联邦理工学院，中国科学院上海药物研究所，中国中医科学院中药研究所，丽珠医药集团股份有限公司，康龙化成（宁波）生物医药有限公司，中日医院呼吸病学研究中心/中日友好临床医学研究所，北京中医药大学，中国药科大学，沈阳药科大学，复旦大学，浙江大学，四川大学，中南大学湘雅医学院等
24h技术服务和销售热线：17810632981 （手机号码同微信号）
公司官网：www.yskdbt.com
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