01. 前 言
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞株因其快速生长以及优秀的外源蛋白表达能力而常被选择作为治疗型蛋白的生产细胞株。然而，细胞培养在诸多环节仍存在瓶颈，例如转染后恢复、单细胞分离后分裂、静态转震荡培养等阶段，细胞都会受到不同程度的压力影响。尤其是在单细胞分离后细胞的代谢需求得不到满足，会极大的影响克隆增殖，直接影响项目进程。

在这里，我们展示了来自安达望（Advanced Instruments）的促单细胞生长因子 InstiGRO CHO 及其增强版 InstiGRO CHO PLUS 解决因克隆扩增效果不佳而导致的细胞株开发低效问题的有效解决方案。InstiGRO CHO 及其增强版 InstiGRO CHO PLUS 使用无动物成分配方，旨在促进单细胞形成健康的克隆团，加速工艺流程。此外，安达望对 InstiGRO CHO PLUS 产品配方进一步优化，使得单克隆恢复率及克隆团生长速度方面有了进一步的提升，并且对某些表达特殊蛋白生长困难的克隆有显著效果。

本文展示了康日百奥 CLD 团队使用 InstiGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 优化已有平台工艺的实验结果。本实验使用表达一种特定蛋白的 CHO-K1 细胞株，使用 VIPS^® 进行单细胞铺板及 Cell Metric^® 进行单克隆成像，分别使用原工艺培养体系 CM A 以及 InstiGRO CHO+CM B、InstiGRO CHO PLUS+CM B 三个条件进行单克隆培养。通过平均克隆汇合度和平均克隆恢复率来判断最优培养体系。我们发现使用 InstiGRO CHO 以及 InstiGRO CHO PLUS 时，克隆恢复率相对原工艺提高近 2 倍。使用 InstiGRO CHO 的平均克隆汇合度相对原工艺提高约 2 倍，而使用 InstiGRO CHO PLUS 的平均克隆汇合度相对原工艺提高约 8 倍。该结果证明，InstiGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 能够促进分离后的单细胞成活，增加单克隆恢复率，获得更多阳性克隆。同时，它们还能促进克隆生长速度，缩短培养周期，加速工艺流程。

02. 材料与方法
我们选取表达一种特定蛋白的细胞株 CHO-K1，使用 VIPS 进行单细胞铺板，将待铺细胞密度稀释到 8000-10000 cells/mL 进行单克隆铺板，以保证铺板效率。分别使用原有培养体系 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三个培养条件，每个条件铺 1 块 96 孔板（康宁 3599）。

在铺板后，培养板在 37°C 和 8% CO₂ 的条件下孵育 16 天。使用 Cell Metric^® 对培养板进行整板成像（从第 0 天到第 16 天）。在第 7、14 天，利用 Cell Metric 软件进行汇合度分析。评估了第 7 天和第 14 天的克隆汇合度百分比，以及克隆恢复率。

03. 结 果
InsitGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 提高克隆恢复率并促进克隆增殖。
铺板后分别对 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三个培养条件进行克隆生长追踪成像，第 16 天，统计形成明显克隆团的单克隆孔数量，计算单克隆成活率（单克隆成活率（%）=成活单克隆孔数量/铺入单克隆孔数量*100），如图 1 所示，A-C 分别为 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三个条件第 0 天铺板结果示意图，其中绿色孔为铺入单细胞的孔，灰色孔为无细胞孔，红色孔为铺入多细胞的孔，平均铺板率为 74%。D-F 为三个条件在第 16 天的整孔图像，图像显示，添加 InstiGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 的单克隆生长相较于未添加 InstiGRO CHO 的单克隆生长更快，形成的克隆团更大；而添加 InstiGRO CHO PLUS 的单克隆生长相较于添加 InstiGRO CHO 的单克隆生长更快，形成的克隆团更大。

图 1：A-C 分别为 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS+CM B 三个培养条件 VIPS 单细胞铺板结果，红色代表铺入的多个细胞的孔，绿色代表铺入单细胞的孔，灰色代表无细胞孔。

D-F 分别为 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS+CM B 三个培养条件第 16 天整孔成像结果，红色叉号代表不计入统计的孔，绿色圆圈代表计入统计的单克隆来源的孔。

使用 Cell Metric 软件汇合度算法，对克隆团汇合度自动计算，如图 2 显示，CM A，InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三个条件在第 7 天汇合分别为 4.14%、3.96% 以及 4.42%，无显著差别。克隆生长到第 16 天时，汇合度分别为 7.91%、16.74% 以及 61.96%，即添加 InstiGRO 试剂能够显著增加克隆团生长，且 InstiGRO CHO PLUS 相对于 InstiGRO CHO 效果更加明显。

图 2：CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三个培养条件下第 7 天及第 16 天单克隆汇合度数据。蓝色的代表第 7 天，橘色代表第 16 天。

此外，添加 InstiGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 的条件相较于未添加 InstiGRO CHO 的条件，单克隆数量更多，即克隆恢复率更高，如图 3，原工艺下单克隆恢复率为 18.29%，添加 InstiGRO CHO 的条件单克隆恢复率为 31.42%，添加 InstiGRO CHO PLUS 的单克隆恢复率为 29.79%。

图 3：CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三个培养条件下第 16 天单克隆恢复率。

04. 结论与讨论
在单克隆建系中，由于分离后单细胞独自生长缺少共生长分泌因子，单克隆恢复率低是个普遍问题。InstiGRO CHO 以及 InstiGRO CHO PLUS 能够促进单细胞成活，并加快单细胞生长。同时，它们可以帮助科学家们挑出更多的候选阳性克隆，并且能提早对克隆进行扩增，加速整体工作流程。

作者：
刘玉梅，刘星星；康日百奥生物科技（苏州）有限公司
张倩倩；安达望（上海）科技有限公司