关键词：LUNA-III™ 自动细胞计数仪、PBMC、偏移校正功能、台盼蓝染色、细胞浓度与活力评估

介绍
外周血单核细胞（PBMC）在感染性疾病、自身免疫疾病和肿瘤免疫学等研究领域中发挥着至关重要的作用，确保研究结果的一致性和可重复性对于获得可靠、精准的结论也至关重要。然而，由于PBMC的特性及样本质量的影响，其精确计数面临诸多挑战。PBMC体积较小，边缘不够清晰，可能影响检测准确性。此外由于PBMC来源于血液，其分离过程中常伴有大量细胞碎片和潜在的红细胞（RBC）污染，这些因素可能降低自动对焦性能，从而导致细胞计数和活力测定的误差。
       
鉴于上述限制，通常推荐使用基于荧光检测的细胞计数仪，例如LUNA-FX7™自动细胞计数仪，以提高PBMC计数的准确性。然而，在仅使用明场光学系统的经济型方案中，实现精准的PBMC计数仍具有一定挑战性。为了解决这个问题，LUNA-III™自动细胞计数仪开发了一项新策略，结合焦平面偏移校正技术和优化的细胞检测算法，以提升检测精度。同时使用台盼蓝（Trypan Blue, TB）等染色溶液能够增强细胞边缘的可见度，从而进一步提高检测准确性。
       
本应用说明将通过对比LUNA-III™自动细胞计数仪与LUNA-FX7™自动细胞计数仪在 PBMC 计数和活力测定中的表现，以验证LUNA-III™在该应用中的有效性，并证明其作为一种可靠且经济的解决方案的可行性。

材料和方法
人外周血经标准密度梯度离心法处理，以Histopaque-1083（Sigma，#10831）分离获得 PBMC（外周血单核细胞）样本。在最终洗涤后，将富含血沉棕黄层的PBMC重悬于含 1% BSA的PBS溶液中。
       
在系列稀释测定中，PBMC以 1 至 32 倍的不同稀释因子进行梯度稀释。同时，另行制备了一批用于活力测定的 PBMC 样本，并设定理论细胞活力水平分别为0%、25%、50%、75%和100%。细胞计数与活力测定采用LUNA-III™自动细胞计数仪进行，使用LUNA™细胞计数专用载片，并启用内置PBMC计数程序（见表 1）。
       
在上样前，细胞样本按 1:1 体积比与0.4%台盼蓝溶液（货号T13001）混合。此外，同一批样本亦用于LUNA-FX7™自动细胞计数仪测试，以对比两者的测定结果。
在 LUNA-III™ 上使用不同偏移水平评估 PBMC 浓度及活力
使用LUNA-III™和LUNA-FX7™在三个不同的偏移水平（0、1 和 2）下测试PBMC样本，以验证其在不同浓度和活力水平下的线性关系。
       
所有偏移水平下的细胞浓度均表现出较强的相关性，R²值均在 0.9921 以上（图 1A）。尽管所有偏移水平均表现出良好的线性，但偏移水平 2 的测量结果最接近 LUNA-FX7™ 的数据。此外，LUNA-III™ 能够准确识别并标记 PBMC（图 1B）。
图1. (A) 在不同稀释梯度的 PBMC 样本中，LUNA-III™ 细胞计数与理论细胞浓度之间的线性关系。
(B) 使用 LUNA-III™ BF-total 模式检测不同稀释水平的代表性图像。橙色圆圈标记 LUNA-III™ 识别出的细胞，检测到的细胞数量从左至右逐渐增加，对应的稀释倍数范围为 1 至 32。
BF-total：测量细胞总数的明场细胞计数模式。
 
在三个偏移水平（0、1 和 2）下进行细胞活力测定，并与LUNA-FX7™的活力数据进行对比分析。尽管偏移水平1和2与理论活力值表现出较强的相关性（R² = 0.9906 和 0.9987），但仅有偏移水平2的结果与LUNA-FX7™数据高度一致（图 2A）。偏移水平0与理论活力值的相关性较低（R² = 0.9579），且其测量结果与LUNA-FX7™存在较大偏差。在LUNA-III™系统中，偏移水平2对不同活力水平的活细胞与死细胞标记最为准确（图 2B）。

图2. (A) 比较 LUNA-III™ 在三个偏移水平（0、1 和 2）下测得的细胞活力与 LUNA-FX7™ 的测量结果。
(B) LUNA-III™ 在偏移水平 0、1 和 2 下的细胞活力标记示例图。红色圆圈表示死亡细胞，绿色圆圈表示存活细胞。
*LUNA-FX7™ BF-Viability：LUNA-FX7™ 使用明场成像评估细胞活力的计数模式。

使用台盼蓝染色法进行外周血单核细胞（PBMC）计数的局限性
尽管我们的研究结果证明了使用LUNA-III™进行PBMC的台盼蓝染色法是有效的，但该方法在PBMC计数方面存在显著局限性。台盼蓝染色法的一个主要问题是无法区分PBMC与污染物，如红细胞和碎片。这可能导致总细胞计数的过高估算以及细胞活性的不准确评估，因为污染物可能被错误地计为死亡细胞。相比之下，荧光染色方法，如LUNA-FX7™等基于荧光的细胞计数器所使用的方法，通过选择性地识别活细胞和死亡细胞，并有效排除污染物，提供更为准确的评估。因此，对于可能含有红细胞或碎片的PBMC样本，强烈建议使用荧光染色方法，以确保结果的精准性，特别是在细胞活性和总细胞计数要求高准确度时。

结论
LUNA-III™通过集成焦平面偏移和先进的细胞检测算法，显著提高了PBMC计数和活性评估的准确性和精确度，其中偏移级别2的表现与LUNA-FX7™的高性能非常匹配。然而需要认识到，尽管LUNA-III™提供了一种具有成本效益的解决方案，使用台盼蓝染色法仍可能面临挑战。台盼蓝染色法无法区分PBMC与污染物（如红细胞和碎片），这可能导致细胞计数的过高估计和活性读数的不准确，因为污染物可能被误计为死亡细胞。因此，用户在处理PBMC样本时必须考虑这些局限性，特别是在对活性测量要求更高精度的情况下。

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