DAP-seq技术助力揭示小麦氮高效利用与产量提升的分子机制
2025-11-26 来源:本站 点击次数:992025年9月27日，中国农业大学孙其信院士/邢界文教授团队在Molecular Plant（IF: 24.1）在线发表了题为An incoherent feed-forward loop coordinates nitrate uptake and tillering in wheat的研究论文，该研究揭示了小麦中TaNLP3通过非一致性前馈环（incoherent feed-forward loop）协同调控硝酸盐吸收与分蘖的分子机制，还鉴定出可直接用于育种的优异单倍型。蓝景科信为该研究提供了DAP-seq技术支持。
文章主要内容
小麦作为全球近20%人口的主食来源，其产量和氮素利用效率（NUE）直接关系到粮食安全与农业可持续发展。自绿色革命以来，氮肥施用大幅提升了小麦产量，但如今增产效应已进入平台期——过量施氮不仅降低NUE，还会催生大量无效分蘖，造成资源浪费。如何让小麦在氮素波动环境中“智能”平衡硝酸盐吸收与有效分蘖，成为小麦遗传改良中的核心问题。
主要研究结果
核心发现一：关键基因鉴定与功能解析——锁定硝酸盐响应核心因子
主要研究结果
核心发现一：关键基因鉴定与功能解析——锁定硝酸盐响应核心因子
- 关键标记基因鉴定：TaNRT2.1-6B4 是氮响应与分蘖的“信号枢纽”
本研究通过对缺氮后复氮处理的小麦幼苗进行不同时间点（15min、1h、6h）RNA-seq分析，结合GO富集分析与候选基因关联分析，鉴定到TaNRT2.1-6B4为小麦硝酸盐响应关键标记基因，其表达量与分蘖数呈显著正相关，且受硝酸盐强烈诱导（转录水平提升5-180倍），成为连接氮吸收与分蘖发育的关键“信号枢纽”。
- 核心调控因子鉴定：TaNLP3 是平衡氮吸收与分蘖的“总开关”
通过酵母单杂筛选TaNRT2.1-6B4的上游调控因子，团队鉴定出NIN-like蛋白家族成员TaNLP3。转录组数据显示，TaNLP3不受短期施氮诱导，且在不同氮磷供给组合条件下表达量保持稳定。亚细胞定位、瞬时荧光素酶（LUC）、酵母转录激活实验等技术验证基因表达特征与转录激活功能。结果显示TaNLP3作为硝酸盐信号通路的核心转录因子，定位于细胞质与细胞核，硝酸盐处理可促进其核滞留，其C端具有最强转录激活活性，N端片段次之，全长蛋白的激活活性最弱。
图1 TaNRT2.1-6B4 是受TaNLP3正调控的关键硝酸盐响应标记基因
利用CRISPR-Cas9技术构建TaNLP3敲除株系，通过田间试验（正常氮/低氮条件）与水培试验，系统分析植株表型、氮含量及15N吸收速率，结果显示TaNLP3敲除显著降低小麦株高、分蘖数及产量，且在正常氮条件下表型缺陷更显著，但植株氮含量未受影响；此外在硝酸盐诱导（NI）条件下敲除TaNLP3抑制硝酸盐吸收，而在低氮（LN）和正常氮（NN）稳态条件下不影响甚至促进吸收。表型分析表明，TaNLP3以氮素依赖的方式调控硝酸盐吸收和小麦分蘖——在硝酸盐诱导（短期氮信号）下，它主要促进硝酸盐吸收；在正常氮供应（长期氮信号）下，它更侧重调控分蘖发育，完美适配小麦在不同氮环境中的生长需求。
图2 TaNLP3在短期和长期硝酸盐处理下调控不同基因的表达
核心发现二：硝酸盐信号调控网络构建——解析协同调控分子路径
1、TaNLP3–TaLBD38–TaNRT2.1 构成非一致性前馈环路
为解析TaNLP3在短期和长期硝酸盐信号中功能背后的调控网络，作者对TaNLP3敲除株系与Fielder对照在不同氮条件（NN、NS、NI）下的根系和地上部分进行转录组测序（RNA-seq），鉴定到调控小麦分蘖过程中的关键下游候选基因TaLBD38，原位杂交结果显示，TaLBD38与TaNLP3均在小麦分蘖芽中表达，随后通过对正常氮条件下生长的Fielder 和Tanlp3-4的分蘖芽进行了转录组测序验证了TaNLP3–TaLBD38调控级联在分蘖发育中的作用。
不同氮素条件下TaNRT2.1家族基因与TaLBD38的表达热图显示，二者具有基因特异性的硝酸盐响应模式，结合此前研究证实LBD家族成员参与氮素利用和地上部分枝调控，作者提出：小麦硝酸盐信号通路中，TaNLP3、TaLBD38与TaNRT2.1构成非一致性前馈环路：短期信号中，TaNLP3感知硝酸盐信号后进入细胞核，激活TaNRT2.1以增强硝酸盐吸收，同时诱导TaLBD38 表达；长期信号传导中，积累的TaLBD38蛋白会抑制TaNRT2.1的表达，避免硝酸盐过量吸收，进而促进分蘖形成。进一步EMSA、LUC、ChIP-qPCR等分子实验表明TaNLP3可结合并激活TaNRT2.1-6B4和TaLBD38-4A的启动子；而TaLBD38则结合并抑制TaNRT2.1-6B4的启动子。EMS突变体的RT-qPCR、表型与氮含量测定证实TaLBD38缺失会致氮吸收异常与发育缺陷。上述结果均证明该环路实现了硝态氮吸收与分蘖形成的动态平衡。
1、TaNLP3–TaLBD38–TaNRT2.1 构成非一致性前馈环路
为解析TaNLP3在短期和长期硝酸盐信号中功能背后的调控网络，作者对TaNLP3敲除株系与Fielder对照在不同氮条件（NN、NS、NI）下的根系和地上部分进行转录组测序（RNA-seq），鉴定到调控小麦分蘖过程中的关键下游候选基因TaLBD38，原位杂交结果显示，TaLBD38与TaNLP3均在小麦分蘖芽中表达，随后通过对正常氮条件下生长的Fielder 和Tanlp3-4的分蘖芽进行了转录组测序验证了TaNLP3–TaLBD38调控级联在分蘖发育中的作用。
不同氮素条件下TaNRT2.1家族基因与TaLBD38的表达热图显示，二者具有基因特异性的硝酸盐响应模式，结合此前研究证实LBD家族成员参与氮素利用和地上部分枝调控，作者提出：小麦硝酸盐信号通路中，TaNLP3、TaLBD38与TaNRT2.1构成非一致性前馈环路：短期信号中，TaNLP3感知硝酸盐信号后进入细胞核，激活TaNRT2.1以增强硝酸盐吸收，同时诱导TaLBD38 表达；长期信号传导中，积累的TaLBD38蛋白会抑制TaNRT2.1的表达，避免硝酸盐过量吸收，进而促进分蘖形成。进一步EMSA、LUC、ChIP-qPCR等分子实验表明TaNLP3可结合并激活TaNRT2.1-6B4和TaLBD38-4A的启动子；而TaLBD38则结合并抑制TaNRT2.1-6B4的启动子。EMS突变体的RT-qPCR、表型与氮含量测定证实TaLBD38缺失会致氮吸收异常与发育缺陷。上述结果均证明该环路实现了硝态氮吸收与分蘖形成的动态平衡。
图3 TaNLP3通过非一致性前馈环调控TaNRT2.1与TaLBD38的表达，进而协同调控硝酸盐吸收与分蘖
2、TaLBD38通过抑制TaCKX4/5调控分蘖
为筛选TaLBD38介导的分蘖调控关键基因，作者对野生型和3个TaLBD38 RNAi株系10天龄幼苗进行了转录组测序。根的转录组分析结果显示，TaLBD38调控的差异基因广泛参与养分利用过程，包括硝酸盐转运与同化、氨基酸转运、铁离子转运及磷酸盐调控。与根系DEGs不同，茎部DEGs富集于BR、赤霉素（GA）和细胞分裂素（CK）信号通路。由于TaLBD38是一种转录抑制因子，其直接调控靶点在RNAi细胞系中被上调。根据这一标准，结合水稻相关研究推断出TaCKX4/5是介导TaLBD38调控分蘖的主要下游靶点。随后通过RT-qPCR，LUC和EMSA实验证实TaLBD38直接结合并抑制细胞分裂素降解酶基因TaCKX4/5的启动子，提高局部细胞分裂素水平，促进分蘖形成。
为筛选TaLBD38介导的分蘖调控关键基因，作者对野生型和3个TaLBD38 RNAi株系10天龄幼苗进行了转录组测序。根的转录组分析结果显示，TaLBD38调控的差异基因广泛参与养分利用过程，包括硝酸盐转运与同化、氨基酸转运、铁离子转运及磷酸盐调控。与根系DEGs不同，茎部DEGs富集于BR、赤霉素（GA）和细胞分裂素（CK）信号通路。由于TaLBD38是一种转录抑制因子，其直接调控靶点在RNAi细胞系中被上调。根据这一标准，结合水稻相关研究推断出TaCKX4/5是介导TaLBD38调控分蘖的主要下游靶点。随后通过RT-qPCR，LUC和EMSA实验证实TaLBD38直接结合并抑制细胞分裂素降解酶基因TaCKX4/5的启动子，提高局部细胞分裂素水平，促进分蘖形成。
图4 TaLBD38通过在根部抑制TaNRT2.1家族基因的表达以限制硝酸盐吸收，同时在地上部抑制TaCKX4/5的表达以促进分蘖
核心发现三：染色质层面调控——TaNLP3与SWI/SNF复合物协同“解锁”靶基因
为了揭示TaNLP3调控基因表达的深层机制，作者以TaNLP3为诱饵进行Y2H实验，鉴定出62个候选相互作用物。其中，SWI/SNF染色质重塑复合物为关键物质。Co-IP、LUC和双分子荧光互补实验进一步证实TaNLP3无论体内体外均可与SWI/SNF亚基TaSYD、TaSNF5直接相互作用。
为了揭示TaNLP3调控基因表达的深层机制，作者以TaNLP3为诱饵进行Y2H实验，鉴定出62个候选相互作用物。其中，SWI/SNF染色质重塑复合物为关键物质。Co-IP、LUC和双分子荧光互补实验进一步证实TaNLP3无论体内体外均可与SWI/SNF亚基TaSYD、TaSNF5直接相互作用。
图5 SWI/SNF 染色质重塑复合体与 TaNLP3 相互作用，调控小麦硝酸盐响应
为了研究TaNLP3敲除是否在全基因组水平上影响染色质状态，团队运用转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）分析TaNLP3敲除株系与Fielder对照在NS和NI条件下的全基因组染色质可及性差异。结果显示TaNLP3是硝酸盐诱导的染色质重塑关键调控因子，并且鉴定到23365个受硝酸盐和TaNLP3共同调控的可及染色质区域。为进一步明确哪些差异可及染色质区域可能受TaNLP3直接调控，作者进行了DNA亲和纯化测序（DAP-seq）鉴定TaNLP3的直接靶基因。两个重复交集中鉴定到18941个靶基因，这些18941个基因共鉴定出54018个峰，其中90%的结合峰位于转录起始位点（TSS）上游5kb调控区。整合ATAC-seq和DAP-seq数据分析发现，4008个基因既与硝酸盐和TaNLP3共同调控的可及染色质区域相关，又是DAP-seq鉴定的TaNLP3直接靶基因，这些重叠基因中包含许多氮素相关基因，包括参与硝酸盐吸收、硝酸盐同化和硝酸盐信号调控的基因。IGV峰图，显示TaNRT2.1-6B4和TaLBD38-4A位点的染色质可及性显著提高，且存在TaNLP3强结合信号，这些位点的DAP-seq峰为TaNLP3直接结合并调控这些关键硝酸盐响应基因的启动子提供了有力证据。染色质可及性的增加通常伴随着活跃的表观遗传修饰，因此检测了四个氮相关基因（TaNRT2.1-6B4、TaNIA1-6A、TaNIA1-6B 和TaLBD38-4A）启动子区域的H3K9ac水平。ChIP–qPCR结果显示NI条件下，Fielder中H3K9ac水平显著高于NS条件；而敲除TaNLP3后，NI条件下H3K9ac水平大幅下降。这些发现表明，TaNLP3在小麦硝酸盐响应过程中对染色质可及性的调控具有不可或缺的作用。
图6 TaNLP3 通过调控其靶基因处的染色质可及性，进而调控硝酸盐响应基因的表达
核心发现四：育种新资源——3个优异单倍型实现“高产+高NUE”
为评估TaNLP3-TaLBD38-TaNRT2.1调控模块的育种潜力，团队对405份小麦种质资源（359个栽培种、46个地方品种）进行单倍型分析，鉴定出3个关键基因的优异单倍型：TaNLP3-3BHap2、TaLBD38-4AHap2 和 TaNRT2.1-6B4Hap1。这些优异单倍型在现代栽培种中的频率呈下降趋势（部分从70%降至30%），这为通过分子标记辅助育种、回补优异单倍型提供了重要靶点——将这些单倍型聚合到同一品种中，有望培育出“低氮高产、高氮高效”的小麦新品种。
为评估TaNLP3-TaLBD38-TaNRT2.1调控模块的育种潜力，团队对405份小麦种质资源（359个栽培种、46个地方品种）进行单倍型分析，鉴定出3个关键基因的优异单倍型：TaNLP3-3BHap2、TaLBD38-4AHap2 和 TaNRT2.1-6B4Hap1。这些优异单倍型在现代栽培种中的频率呈下降趋势（部分从70%降至30%），这为通过分子标记辅助育种、回补优异单倍型提供了重要靶点——将这些单倍型聚合到同一品种中，有望培育出“低氮高产、高氮高效”的小麦新品种。
图7 小麦种质资源中TaNLP3、TaLBD38 及 TaNRT2.1的单倍型分析
小结
该研究阐明了TaNLP3作为核心调控因子，通过与SWI/SNF复合体协作重塑染色质可及性，借助不一致性前馈环实现硝酸盐吸收与分蘖形成的时空协同。不仅深化了对作物氮信号网络的理解，也为通过分子设计培育“高产高效”小麦品种提供了新靶点与遗传资源。
该研究阐明了TaNLP3作为核心调控因子，通过与SWI/SNF复合体协作重塑染色质可及性，借助不一致性前馈环实现硝酸盐吸收与分蘖形成的时空协同。不仅深化了对作物氮信号网络的理解，也为通过分子设计培育“高产高效”小麦品种提供了新靶点与遗传资源。
图8 TaNLP3介导的染色质可及性调控及小麦氮-分蘖平衡模型
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2025.09.020
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