试剂追踪平台用于验证提供T细胞免疫斑点法检测的无错误实施审计轨迹
2025-12-08 来源:本站 点击次数:52
试剂追踪平台™用于验证并提供T细胞免疫斑点法检测的无错误实施审计轨迹
摘要
ELISPOT 和 FluoroSpot检测方法，统称为ImmunoSpot检测法，能够可靠地检测新近分离的细胞材料(如外周血单核细胞【PBMC】)中稀有的抗原特异性T细胞。确定这些细胞在所有PBMC 中的频率有助于评估抗原特异性T细胞免疫力的规模;同时测量其细胞因子标志物则能揭示这些T细胞的谱系及效应功能，即T细胞介导免疫的质量。由于其无与伦比的灵敏度、实施便利性、可靠性以及对 PBMC利用的节约性，T细胞ImmunoSpot检测法正日益成为标准免疫监测方法库中不可或缺的一部分。 对于受监管的工作流程而言，对生成的数据进行严格的审计追踪是一项必要条件。尽管这在分析T细胞免疫斑点检测结果时已完全实现，但对于实际测试中湿实验室环节的执行工作而言，此类追踪尚属缺失。在此，我们提出一种解决方案，旨在增强并验证T 细胞免疫斑点检测的无误执行过程。
ELISPOT和FluoroSpot检测均能直观显示单个细胞的分泌痕迹[1]这两种测试系统仅在板载分析物的可视化层面有所不同：在前者中，检测抗体被耦合至一种酶，该酶能够催化生成一种在白光下可被检测到的沉淀性底物；而在后者中，板载分析物则通过荧光标记的检测抗体进行可视化。ELISPOT适用于单色和双色分析[2]而对于需对超过 2 种分析物进行明确测量的情形，则需采用 FluoroSpot 测试方法，该方法使用光谱不重叠的荧光染料[3]除此之外，这两种检测方法完全相同，我们统称为“免疫斑点”
免疫斑点 ® 检测技术在 T 细胞免疫监测领域得到了广泛应用。这归因于其检测系统对检测 PBMC 和其他新分离细胞材料中抗原特异性 T 细胞（除极少数情况外，此类细胞通常以极低频率出现）的空前高灵敏度[4]该检测方法的成功还得益于其对细胞利用率的节约性（见注释 1）。即使在冷冻保存的PBMC样本被进行检测时，其性能也不会受到影响[5]最后但同样重要的是，ImmunoSpot®} 检测方法的简洁性和可靠性使其非常适合用于临床试验中的监管验证[8]PBMC 的经济实用性，加之 ImmunoSpot®} 的高通量能力，使得我们能够批量检测数十乃至数百名受试者的 PBMC，以评估其 T 细胞对数百种个体抗原/肽的反应性，而每位捐赠者均可参与此项检测[9]此类试剂至关重要，例如在高分辨率 CD8+ T 细胞免疫监测中的应用。由于 CD8+ T 细胞对表位/肽段的识别在纯合子个体间具有高度可变性和不可预测性（“随机”）【10、20、21】，只有通过对广泛肽库进行测试才能全面评估个体中抗原特异性 CD8+ T 细胞库的规模和精细特异性。然而，在进行涉及众多捐赠者 PBMC 和多种抗原的复杂测试时，存在重大的人为错误风险。为克服这一问题，我们引入了中性的“试剂追踪”染料[11]这有助于进行视觉验证：（a） 正确的抗原是否已铺入正确的孔中，（b） 正确的量/体积的抗原是否已铺就，（c） 细胞是否已添加（d） 并达到正确的数量/体积。图 1 中展示了一个典型的 96 孔板，其上标记有 Reagent-Tracker®}抗原（参见注释 2）。在本章中，我们将介绍一款软件工具——Reagent Tracker（RT）软件™这有助于通过自动化图像分析来验证 ImmunoSpot® 检测方法实施的准确性，同时还能提供防篡改的审计追踪记录（见注释 3）。图 2a 显示，Reagent Tracker®} 染料在 3D 彩色空间中可通过图像分析轻松区分：每种染料的颜色均可被表示为 RGB 坐标的紧密集群。这使得 RT 软件能够...™为了明确验证某孔中实际呈现的颜色是否确实与预想应存在于该孔中的颜色（抗原/肽）相符。若出现与这些颜色坐标值不符的情况，则表明存在杂质，例如由抗原洒落所致。软件会自动识别并对此进行标注。这些定义好的颜色的光学密度反映了每孔所涂布的体积，从而有助于识别定量抗原移液操作的误差。RT 软件™该系统还能自动评估此类偏离计划产量的情况是否已出现，从而能够对异常油井进行标记。
图 1 对移液准确性的颜色编码验证。（a） 展示的是标准 96 孔 T 细胞免疫斑点®}板，未显示试剂追踪器™染色后，每孔加入 100 μL 的抗原和 PBMC，两者均置于含有酚红的中性介质中。由于所有孔的外观都相似，因此无法验证加样操作的准确性。（b）ImmunoSpot®}板：在使用不含酚红的中性介质对彩色编码抗原进行加样后使用该板进行检测。在所示示例中，使用了 8 个 Reagent Tracker™染料被用于对抗原进行颜色编码；每种抗原均被铺设在彼此相邻的复孔板中。（c）在加入 100 μL 含酚红介质中的 PBMC 后，B 所示的板面情况
图 2 试剂追踪器定义™在 RGB 空间中的染料。（a）图 1b 中所示的板片被扫描至 ImmunoSpot® Reader} 设备上，而包含八种 RT 染料的孔则被分别定义在了红–绿–蓝色彩空间中。坐标轴以相应颜色显示。（b）图 1c 中所示的板片被扫描，色彩空间亦被如上定义。请注意，在添加含有酚红介质中的细胞后，每种颜色的 RGB 坐标点均发生了显著偏移
如图 1b 与 1c、图 2a 与 2b 中所示，在含有酚红介质中加入 PBMC 后会导致 RT 染料出现明显颜色变化。这种变化可通过 RT 软件进行评估，从而自动验证细胞是否确实被添加至每个孔中，以及计划添加的数量（体积）是否已到位。
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摘要
ELISPOT 和 FluoroSpot检测方法，统称为ImmunoSpot检测法，能够可靠地检测新近分离的细胞材料(如外周血单核细胞【PBMC】)中稀有的抗原特异性T细胞。确定这些细胞在所有PBMC 中的频率有助于评估抗原特异性T细胞免疫力的规模;同时测量其细胞因子标志物则能揭示这些T细胞的谱系及效应功能，即T细胞介导免疫的质量。由于其无与伦比的灵敏度、实施便利性、可靠性以及对 PBMC利用的节约性，T细胞ImmunoSpot检测法正日益成为标准免疫监测方法库中不可或缺的一部分。 对于受监管的工作流程而言，对生成的数据进行严格的审计追踪是一项必要条件。尽管这在分析T细胞免疫斑点检测结果时已完全实现，但对于实际测试中湿实验室环节的执行工作而言，此类追踪尚属缺失。在此，我们提出一种解决方案，旨在增强并验证T 细胞免疫斑点检测的无误执行过程。
ELISPOT和FluoroSpot检测均能直观显示单个细胞的分泌痕迹[1]这两种测试系统仅在板载分析物的可视化层面有所不同：在前者中，检测抗体被耦合至一种酶，该酶能够催化生成一种在白光下可被检测到的沉淀性底物；而在后者中，板载分析物则通过荧光标记的检测抗体进行可视化。ELISPOT适用于单色和双色分析[2]而对于需对超过 2 种分析物进行明确测量的情形，则需采用 FluoroSpot 测试方法，该方法使用光谱不重叠的荧光染料[3]除此之外，这两种检测方法完全相同，我们统称为“免疫斑点”
免疫斑点 ® 检测技术在 T 细胞免疫监测领域得到了广泛应用。这归因于其检测系统对检测 PBMC 和其他新分离细胞材料中抗原特异性 T 细胞（除极少数情况外，此类细胞通常以极低频率出现）的空前高灵敏度[4]该检测方法的成功还得益于其对细胞利用率的节约性（见注释 1）。即使在冷冻保存的PBMC样本被进行检测时，其性能也不会受到影响[5]最后但同样重要的是，ImmunoSpot®} 检测方法的简洁性和可靠性使其非常适合用于临床试验中的监管验证[8]PBMC 的经济实用性，加之 ImmunoSpot®} 的高通量能力，使得我们能够批量检测数十乃至数百名受试者的 PBMC，以评估其 T 细胞对数百种个体抗原/肽的反应性，而每位捐赠者均可参与此项检测[9]此类试剂至关重要，例如在高分辨率 CD8+ T 细胞免疫监测中的应用。由于 CD8+ T 细胞对表位/肽段的识别在纯合子个体间具有高度可变性和不可预测性（“随机”）【10、20、21】，只有通过对广泛肽库进行测试才能全面评估个体中抗原特异性 CD8+ T 细胞库的规模和精细特异性。然而，在进行涉及众多捐赠者 PBMC 和多种抗原的复杂测试时，存在重大的人为错误风险。为克服这一问题，我们引入了中性的“试剂追踪”染料[11]这有助于进行视觉验证：（a） 正确的抗原是否已铺入正确的孔中，（b） 正确的量/体积的抗原是否已铺就，（c） 细胞是否已添加（d） 并达到正确的数量/体积。图 1 中展示了一个典型的 96 孔板，其上标记有 Reagent-Tracker®}抗原（参见注释 2）。在本章中，我们将介绍一款软件工具——Reagent Tracker（RT）软件™这有助于通过自动化图像分析来验证 ImmunoSpot® 检测方法实施的准确性，同时还能提供防篡改的审计追踪记录（见注释 3）。图 2a 显示，Reagent Tracker®} 染料在 3D 彩色空间中可通过图像分析轻松区分：每种染料的颜色均可被表示为 RGB 坐标的紧密集群。这使得 RT 软件能够...™为了明确验证某孔中实际呈现的颜色是否确实与预想应存在于该孔中的颜色（抗原/肽）相符。若出现与这些颜色坐标值不符的情况，则表明存在杂质，例如由抗原洒落所致。软件会自动识别并对此进行标注。这些定义好的颜色的光学密度反映了每孔所涂布的体积，从而有助于识别定量抗原移液操作的误差。RT 软件™该系统还能自动评估此类偏离计划产量的情况是否已出现，从而能够对异常油井进行标记。
图 1 对移液准确性的颜色编码验证。（a） 展示的是标准 96 孔 T 细胞免疫斑点®}板，未显示试剂追踪器™染色后，每孔加入 100 μL 的抗原和 PBMC，两者均置于含有酚红的中性介质中。由于所有孔的外观都相似，因此无法验证加样操作的准确性。（b）ImmunoSpot®}板：在使用不含酚红的中性介质对彩色编码抗原进行加样后使用该板进行检测。在所示示例中，使用了 8 个 Reagent Tracker™染料被用于对抗原进行颜色编码；每种抗原均被铺设在彼此相邻的复孔板中。（c）在加入 100 μL 含酚红介质中的 PBMC 后，B 所示的板面情况
图 2 试剂追踪器定义™在 RGB 空间中的染料。（a）图 1b 中所示的板片被扫描至 ImmunoSpot® Reader} 设备上，而包含八种 RT 染料的孔则被分别定义在了红–绿–蓝色彩空间中。坐标轴以相应颜色显示。（b）图 1c 中所示的板片被扫描，色彩空间亦被如上定义。请注意，在添加含有酚红介质中的细胞后，每种颜色的 RGB 坐标点均发生了显著偏移
如图 1b 与 1c、图 2a 与 2b 中所示，在含有酚红介质中加入 PBMC 后会导致 RT 染料出现明显颜色变化。这种变化可通过 RT 软件进行评估，从而自动验证细胞是否确实被添加至每个孔中，以及计划添加的数量（体积）是否已到位。
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