文章来源公众号：生物屋             作者：屋中人

01 引言
抗体是适应性免疫系统的重要组成部分，由B细胞产生，用于特异性识别和中和多种抗原，如病毒、病原体和恶性细胞。自从Köhler和Milstein在开发杂交瘤技术方面的开创性工作以来，单克隆抗体(mAbs)已成为基础研究和临床医学中不可或缺的工具。迄今为止，已有超过100种治疗性抗体被批准用于临床，为自身免疫性疾病、代谢疾病、传染病和多种癌症提供了有效的治疗选择。治疗性抗体的开发传统上依赖于几种策略，包括动物免疫、组合抗体库、B细胞克隆和转基因小鼠的使用，这些方法使得能够发现具有理想治疗特性的高亲和力抗体。最近，计算生物学和人工智能(AI)的进展为抗体发现引入了强大的新方法。这些工具，如用于结构预测的AlphaFold3、分子对接和从头设计，正越来越多地与生成扩散模型相结合，以创造出具有更高特异性、亲和力和功效的抗体。在本综述中，我们总结了五种主要的抗体生成方法，这些方法(图1)正在扩展治疗性抗体发现的领域，提供了加速开发和改善人类疾病治疗的创新策略。

图1. 治疗性抗体开发的五种关键方法概述：(a) 小鼠杂交瘤, (b) 噬菌体展示, (c) 转基因小鼠, (d) 单B细胞分离, 和(e)从头设计。 每种方法通过不同的免疫、筛选或计算策略实现单克隆抗体的生成。
(a) 小鼠杂交瘤技术： 用靶抗原免疫小鼠，将脾脏B细胞与永生化骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。筛选杂交瘤克隆以获取特异性抗体生产，随后通过互补决定区(CDR)移植进行抗体人源化。
(b) 噬菌体展示： 以单链可变片段(scFv)、抗原结合片段(Fab)或单域抗体(VHH)格式生成组合抗体库。针对固定化抗原进行多轮生物淘选，富集高亲和力结合物用于筛选和IgG重建。
(c) 转基因小鼠平台： 对表达人类免疫球蛋白基因的基因工程小鼠进行靶抗原免疫。从脾脏中分离产生人抗体的B细胞并进行筛选以获得全人源抗体。
(d) 单B细胞分离： 从免疫过或患者的人类供体收集外周血单核细胞(PBMCs)。通过荧光激活细胞分选(FACS)分离抗原特异性B细胞，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增抗体基因，并克隆到表达载体中以获得全人源抗体。
(e) 从头(De novo)抗体设计： 使用人工智能(AI)和基于结构的建模，从支架结构计算生成抗体序列。预测的抗体被表达并通过实验验证其亲和力、稳定性和功能。

02 杂交瘤技术
多年来，抗体一直是生物医学研究中的重要工具，在多个领域具有潜在应用。抗体的高特异性和选择性结合已将其应用扩展到流式细胞术、磁性细胞分选、免疫分析、治疗方法等。1975年，基于杂交瘤的技术被用于生产批次间变异最小的单克隆抗体，实现了持续和无限的生产。杂交瘤技术由Kohler和Milstein于1975年首次发明，作为获取单克隆抗体的一种方法，涉及将免疫动物(如小鼠)脾脏中产生的B细胞与永生化骨髓瘤细胞融合。杂交瘤技术是最原始、最基础且最成功的分离单克隆抗体的方法，这项技术引人注目，并已被用于发现数千种用于各种应用的抗体。杂交瘤技术的基本实际优势在于，一旦杂交瘤克隆建立，单克隆抗体的生产就变得简单而高效。该技术仍然广泛用于抗体治疗和诊断试剂的开发，其核心价值在于保留了来自B细胞自然重组过程的抗体序列完整性和生物活性。第一种治疗性单抗，莫罗单抗-CD3(Orthoclone OKT3)，于1986年获得美国FDA批准，它包含一种针对T细胞表达的CD3的小鼠单抗，作为免疫抑制剂用于治疗急性移植排斥反应。为了规避免疫原性潜力和功效降低的问题，同时使抗体能够长期治疗使用，研究人员开发了技术将啮齿类动物抗体转化为更类似于人抗体的结构，而不损失结合特性。随后，第一种具有肿瘤适应症的单抗，利妥昔单抗，一种嵌合抗CD20 IgG1，于1997年获得美国FDA批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤。最近的创新，例如通过荧光激活细胞分选(FACS)富集的抗体分泌细胞(ASCs)的电融合，显著提高了融合效率和功能性杂交瘤产量。通过选择具有高跨膜激活剂和CAML相互作用因子(TACI)和CD138表达的ASC亚群，研究人员实现了超过60%的抗原特异性单抗生产，且具有纳摩尔级亲和力。这些改进克服了先前随机配对和低PEG介导融合的限制，将杂交瘤定位为一个复兴的、高产量的治疗和诊断抗体开发平台。

除了小鼠杂交瘤，兔单克隆抗体也可以从杂交瘤技术中产生，兔抗体显示出优异的亲和力、更广泛的表位识别(包括隐蔽或构象表位)以及更高的治疗和诊断灵敏度。兔单克隆抗体在几个关键免疫学维度上超越了其鼠源对应物：
·卓越的亲和力——增强的结合动力学能够实现更精确的抗原检测和靶向。
·扩展的表位识别——能够识别结构复杂或在小鼠中免疫原性差的表位。
·对翻译后修饰的敏感性——非常适合检测疾病状态下细微的生化变化。

兔单克隆抗体(RabMAbs)提供高特异性和亲和力，通常能够识别鼠源抗体无法接近的表位，使其对于抗体-药物偶联物(ADCs)和检查点抑制剂具有价值。FDA批准了brolucizumab，一种针对VEGF-A的兔源ScFv，标志着首个治疗性RabMAb的诞生。Brolucizumab是一种单链可变片段(ScFv)单抗，能有效抑制VEGF。由于其小尺寸，与其他治疗性单抗形式相比，ScFv可以以更高浓度递送，并且可以更有效地穿透组织以发挥其治疗作用。然而，使brolucizumab与其他单抗区别开的一个关键点是，它是一种源自兔的人源化ScFv，使得这种单抗成为市场上的首创。相比之下，大多数其他治疗性单抗源自小鼠。其他例子包括Zilovertamab vedotin，一种针对受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)的ADC，以及OR502，靶向白细胞免疫球蛋白样受体B2(LILRB2)以增强抗肿瘤免疫力。

03 噬菌体展示技术
噬菌体展示是首个用于体外抗体筛选的技术，并且仍然是使用最广泛的方法。该技术由George P. Smith于1985年首次描述，他证明了丝状噬菌体可以通过将DNA插入外壳蛋白基因而在其表面呈现外源肽，该技术已得到广泛发展。主要进展来自分子生物学实验室(英国剑桥)的Winter和McCafferty，斯克里普斯研究所(美国拉霍亚)的Lerner和Barbas，以及德国癌症研究中心(德国海德堡)的Breitling和Dubel，他们开创了在丝状噬菌体中构建组合抗体库的工作。这些里程碑牢固确立了噬菌体展示作为治疗性抗体工程的强大平台，导致了全人源抗体的开发。组合抗体库是通过使用PCR从B细胞、免疫供体或患者扩增VH和VL区域，然后克隆到与噬菌体外壳蛋白(如pIII)融合的噬菌粒载体中来构建的。这创建了直接的基因型-表型联系，使得抗体片段能够在噬菌体表面展示。库可以超过 10^11 个变体，提供广泛的多样性。针对固定化抗原进行结合、洗涤和洗脱的迭代轮次富集了抗原特异性噬菌体，之后通过ELISA筛选结合物，进行测序，并重新格式化为scFv、Fab或IgG分子进行测试。重要的是，噬菌体展示绕过了免疫耐受，允许产生针对自身抗原(如TNF-α)的抗体。阿达木单抗(Humira)的批准，第一种噬菌体展示来源的全人单克隆抗体，说明了其临床意义。有许多噬菌体展示来源的人源抗体获得美国FDA批准用于治疗人类疾病，证明了该技术作为抗体发现平台的可靠性。

除了常规的结合物选择，噬菌体展示已经发展到能够实现直接的功能性抗体发现，如图2所示。功能性抗体的鉴定已成为研究的中心焦点，体内和表型筛选方法进一步拓宽了噬菌体展示的应用。在整个生物体中进行基于迁移的选择揭示了能够调节受体多效性和细胞分化的抗体，这些策略使得能够鉴定出驱动干细胞分化为巨噬细胞、小胶质细胞、棕色脂肪细胞或β样细胞命运的抗体。基于形态学的筛选甚至产生了能够防止病毒诱导细胞死亡的抗体。在肿瘤学中，功能性噬菌体展示已鉴定出激活非经典通路的激动剂抗体和一种针对PKM2的抗凋亡胞内抗体，揭示了肿瘤存活的机制。这些进展说明了噬菌体展示如何演变成一个多功能发现引擎，用于寻找超越单纯结合功能的治疗性抗体。此外，从杂交瘤或噬菌体展示获得的抗体通常经过进一步工程化以改善结合。通过在VH/VL区域引入突变并重新选择改进的克隆，噬菌体展示模拟了在V(D)J重组后发生在生发中心的自然亲和力成熟过程。这个过程富集了具有更高抗原亲和力的变体，有时达到低皮摩尔级的结合强度，并且对于优化抗体用于治疗用途至关重要。

图2. 调节细胞命运的功能性抗体发现示意图。

通过慢病毒递送抗体库使得抗体能够在细胞内和表面表达。在细胞和体内进行功能性选择，鉴定出能够调节信号传导、分化和细胞命运的抗体。功能性抗体可以诱导细胞命运的改变，能够被分泌、在细胞质中表达、锚定在质膜上。通过使用抗体库，可以在细胞环境中分离功能性抗体，并修饰细胞表面信号组件的功能。这些抗体还可以以自分泌或旁分泌方式影响细胞存活、增殖和谱系分化，为发现调节细胞稳态和命运决定的抗体提供了一个强大的平台。

04 转基因小鼠技术
源自野生型小鼠的抗体通常需要广泛的下游工程化以消除免疫原性鼠源序列并确保与人类Fc受体的正确相互作用。虽然野生型小鼠广泛可用且使用简单，但它们对于治疗性抗体发现并非最佳选择。为了应对免疫原性的挑战，设计了转基因小鼠模型以产生全人源抗体。然而，这些模型的早期世代缺乏鼠源恒定区，导致B细胞发育缺陷和小鼠体内抗体成熟受损。转基因小鼠技术的原理是通过基因工程将人类免疫球蛋白(Ig)基因引入小鼠基因组，使小鼠能够产生全人源抗体。这通常通过胚胎干细胞(ES细胞)中的同源重组或通过将重组人抗体基因片段显微注射到受精卵中，然后进行胚胎移植和育种以建立稳定的转基因品系来实现。整合的人Ig基因与小鼠免疫系统协同作用，确保正常的B细胞发育、体细胞高频突变和亲和力成熟。与野生型小鼠相比，这些转基因小鼠产生具有更高临床相关性、更低免疫原性并保留免疫监视功能的人源抗体。

·第一个里程碑报道于1989年，Brüggemann等构建了一个包含两个VH片段、多样性(D)元件、JH簇和μ恒定区的人重链基因盒。这个25 kb的构建体通过显微注射到受精卵中随机整合到小鼠基因组中，大约4%的B细胞表达人μ链，并且可以从这些小鼠中产生产生人IgM的杂交瘤。

·Taylor等引入了一个包含单个Vκ、Jκ簇和Cκ的人κ轻链构建体，共表达人VH-D-JH-Cμ-Cγ1和κ构建体的小鼠能够产生人源抗体，但水平低于总Ig的10%，反映了与内源性鼠源Ig表达的有限兼容性。同时，开发了基因敲除小鼠模型以消除内源性鼠源Ig的产生。

·1993年，Chen等通过靶向缺失破坏了鼠源JH和Jκ基因座，废除了天然Ig的表达。当与人类IgH和IgL转基因品系杂交时，这些敲除小鼠显示出更广泛的人源抗体库。

·一个重大进展出现在1994年，Lonberg等产生了HuMabMouse，这是第一个在鼠源Ig缺陷背景下携带人IgH和Igκ基因的小鼠品系。尽管完整的人IgH和Igκ基因座跨越1.29 Mb和1.39 Mb，但引入的构建体小于80 kb，这限制了抗体的多样性。

·随后，应用了酵母人工染色体(YAC)技术。1993年，研究人员使用YAC成功组装了人Igκ(~300 kb)和IgH(~85 kb)的大基因组片段。随后，Green等通过酵母原生质体-ES融合将基于YAC的人Igκ(~170 kb)和IgH(~220 kb)引入小鼠ES细胞。在此基础上，Mendez等生成了更大的YAC构建体，包括人Igκ(~700 kb)和IgH(~1 Mb)，并将它们引入Ig缺陷小鼠，创建了XenoMouse。

这些小鼠仅表达全人源抗体，不受鼠源Ig干扰。总之，转基因动物的开发提供了突破性的平台，使得能够高效生成全人源治疗性抗体。除了XenoMouse，已经开发了越来越多先进的转基因小鼠平台，例如Atlas™ Mouse、HuMab Mouse和VelocImmune® Mouse。这些模型采用精确的基因敲入策略，用近乎全面的人源序列替换鼠源重链和轻链可变区，从而在保留自然结构特征的同时增强抗体多样性。更新一代的模型还融入了创新，如固定轻链或二元轻链策略，这简化了双特异性抗体的高效生成，并改善了可开发性和药代动力学特性。总的来说，这些创新扩展了治疗性抗体的功能多样性，并为药物开发流程提供了更大的灵活性。尽管该技术仍然成本高昂且技术要求高，但此类转基因小鼠模型正迅速成为行业标准，在解决复杂疾病和满足高临床需求方面展现出巨大价值。

05 单B细胞技术
在人类免疫系统中，抗体反应是强大的、高度特异性的，并且通常具有强效的中和作用。生成治疗性单克隆抗体的传统策略，如鼠源杂交瘤技术或使用转基因小鼠，需要冗长的免疫方案和广泛的筛选。此外，鼠源抗体在人类中具有显著的免疫原性风险，常常导致人抗鼠抗体(HAMA)反应的发展。为了克服这些限制，一个早期的替代方案是使用爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)转化永生化人B细胞。虽然这种方法在某些条件下能够生产人源抗体，但它存在关键缺陷，包括在某些供体中效率低下以及EBV转化克隆的不稳定性。一个变革性的进展是单B细胞技术，它允许直接回收人源抗体而无需动物免疫。使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，可以从单个B细胞中扩增可变重链(VH)和轻链(VL)并进行重组表达。B细胞通常从外周血单核细胞(PBMCs)、骨髓或淋巴组织中分离，通常在密度梯度离心后进行，抗原特异性B细胞使用FACS基于阶段特异性标志物进行鉴定和分选。早期的方法使用抗原包被的珠子来富集稀有B细胞，从而产生了第一批针对病毒病原体的人单克隆抗体。如今，多参数流式细胞术和高通量单细胞克隆能够快速鉴定和表达配对的VH/VL基因。这些方法通过提供一种高效、无动物的策略彻底改变了抗体发现，特别适用于紧急公共卫生危机，如新发病毒爆发，例如大流行性流感。这种策略的应用已得到广泛证实，例如，通过使用HIV包膜蛋白作为诱饵，从感染或接种疫苗的个体中分离出了针对HIV-1的广泛中和抗体(bnAbs)。这些抗体通常靶向病毒膜糖蛋白上的保守表位，从而实现强效和交叉反应性中和。最近，单B细胞方法使得能够快速鉴定针对SARS-CoV-2的强效中和抗体，在COVID-19大流行开始后不久，就分离并表征了靶向刺突蛋白的抗体组合，为治疗和疫苗设计提供了关键见解。总的来说，与传统的杂交瘤方法相比，单B细胞抗体发现平台代表了一项变革性的进步，能够更快、更直接、更临床相关地回收全人源单克隆抗体。

06 从头抗体设计
传统的抗体发现和优化技术，如杂交瘤技术、噬菌体展示、转基因小鼠、B细胞克隆等，被广泛用于治疗性抗体筛选。然而，其中一些方法劳动密集、耗时且成本高昂，通常需要六个多月才能产生可行的抗体。随后，通过同源建模、分子对接和基于结构的设计策略，进行优化步骤以增强结合亲和力、生物物理稳定性和可开发性。蛋白质数据获取、GPU计算机和机器学习(ML)的最新进展预计将彻底改变抗体发现和优化筛选的过程，大量蛋白质结构、相互作用和功能数据的可用性为训练复杂的机器学习模型提供了大型数据集，而增强的计算能力使得能够高效执行复杂的模型和模拟。机器学习模型已广泛用于蛋白质研究，涵盖神经网络、转换器和蛋白质语言建模等技术。从头抗体设计是指在不依赖天然模板的情况下生成新的抗体序列。最近的研究使用这种方法，通过模拟抗原-抗体相互作用界面，基于准确的分子间相互作用建模，计算预测具有高结合亲和力的序列。AlphaFold3和 RoseTTAFold模型在直接从氨基酸序列预测蛋白质结构方面达到了高精度，生成模型如 ProteinBERT、ProteinMPNN和 RFdiffusion通过预测蛋白质骨架、为特定结构设计序列以及过滤低质量蛋白质候选物，推进了计算蛋白质设计。研究人员可以使用这些模型来设计和优化具有所需特性的蛋白质，例如酶活性和结合能力。专门模型专注于抗体设计，特别是靶向互补决定区(CDRs)。IgFold可以使用预训练的语言模型和图神经网络快速预测抗体结构，而像DiffAb这样的模型可以用于联合生成靶向CDR优化的抗体序列和结构。

图3： 用于抗体设计的机器学习模式示意图。

基于序列的模型利用氨基酸序列学习表示并生成新的变体，实现从头设计。基于结构的模型结合结构约束来指导序列生成和优化。基于功能的模型利用实验、已发表数据或预测的功能蛋白质(如催化活性或结合)进行监督学习。

用于功能性蛋白质设计的机器学习涵盖三个核心模式：基于序列的模型、基于结构的模型和基于功能的模型(图3)，每种模式利用不同的数据类型来优化蛋白质特性。

·基于序列的模型包括经典的基于比对的方法，使用多序列比对来捕捉进化约束，以及条件生成模型，如变分自编码器和转换器，它们基于家族特异性或序列同源性上下文生成新序列。一个生成对抗网络(GAN)被设计出来，并在超过400,000个人类抗体轻链和重链序列上进行了训练，有效地学习了抗体形成的基本原理。

·基于结构的模型包括结构预测工具，如AlphaFold3和RoseTTAFold，用于创建3D折叠的RF-diffusion模型，以及在结构框架内优化序列的设计模型。David Baker的团队最近开发了RFdiffusion，一个用于从头设计靶向流感血凝素和艰难梭菌毒素B(TcdB)的VHHs和scFvs的生成模型，它在结构和表位靶向方面都达到了原子级精度。这些整合序列和结构数据的方法越来越多地用于迭代优化抗体设计，结合两种模式的优势以增强功能结果。

·基于功能的模型侧重于设计具有特定生物活性的抗体，通常从已知支架开始，并引入靶向突变以增强结合、特异性。这些方法经常参考受体口袋、天然配体或激动剂、拮抗剂相互作用来指导功能性抗体的设计，这些模型使得能够合理设计激动剂、拮抗剂和治疗性蛋白质。

总之，这些模式提供了加速蛋白质工程的互补策略，在抗体设计、优化和合成生物学中的应用日益增长。总的来说，最近的策略汇聚在生成式AI框架内，可以大致分为三类：语言模型、扩散模型和混合模型(图4)。

·语言模型(例如，Absci, AbGPT, AntiBARTy)在大型抗体序列库上进行训练，以生成新序列，特别是在高度多样化的区域，如CDRH3。

·扩散模型细分为基于结构的(例如，RFdiffusion, DiffDock-A)，它们使用来自PDB或SAbDab的实验解析的抗体-抗原复合物来设计新的3D骨架，然后通过Protein MPNN进行序列优化；以及基于序列的(例如，Abdiffuser)，它们利用抗体序列数据集与预测结构来生成新序列。

·混合模型(例如，Refine GNN)整合了配对的序列和结构数据，使得能够同时优化序列和结构。总之，这些生成框架提供了互补的策略，扩展了抗体发现的领域，并加速了功能性治疗候选物的设计。

图4. 使用生成式AI模型生成抗体的示意图。

生成式AI方法包括语言模型(基于序列的设计)、扩散模型(基于序列或结构引导的生成)和混合模型(整合序列和结构进行同步优化)。一个集成框架将抗体发现从已发表的经验筛选转变为数据驱动的设计。

现在，AI辅助的抗体设计已经在多种靶点上展示了显著的通用性，包括病毒蛋白、膜受体致癌蛋白。随着计算建模和高通量实验的融合，从头抗体生成有望成为一个由机器学习和结构生物信息学驱动的自动化、迭代过程。这种整合有望更快、更精确地开发治疗性抗体，加速在癌症、传染病和免疫治疗方面的突破，AI辅助的抗体设计代表了一种正在重塑抗体发现的新趋势。

07 总结与展望
本综述重点介绍了抗体发现的多种策略，包括杂交瘤技术、噬菌体展示库、转基因小鼠、单B细胞分离和从头合成方法。尽管取得了这些进展，但每种抗体发现方法仍然存在独特的挑战和权衡。杂交瘤方法受限于物种特异性免疫反应，如免疫耐受，而噬菌体展示可能引入库偏差并丢失天然抗体配对。转基因小鼠平台成本高昂，单B细胞技术面临通量和数据解释的限制。此外，当前AI驱动和从头计算设计方法仍然难以准确预测抗体折叠、动力学和功能功效，强调了在下一代抗体开发中需要整合、多平台策略。此外，除了这五种抗体生成策略，生产后工程如Fc修饰、半衰期延长和糖工程也持续增强抗体的功效、稳定性和治疗指数。这些创新补充了发现平台，将抗体生成与临床优化连接起来，用于下一代生物制剂。综上所述，总结了五种主要的抗体生成方法，这些方法正在扩展治疗性抗体发现的边界，提供了加速开发过程并增强人类疾病治疗功效的创新策略。总的来说，这些平台不仅能够快速生成传统的中和抗体，还能生成调节信号通路和驱动细胞分化的功能性激动剂。新兴的方法，如基于自分泌和基于迁移的选择、体内功能性筛选和形态学引导的分析，进一步扩展了抗体发现的潜力，特别是在癌症和免疫学领域。这些进展提供了强大的手段来靶向病毒、肿瘤和免疫受体，同时也为受体多效性和细胞命运调控提供了新的见解。从头设计，越来越多地与AI驱动的建模和高通量筛选相结合，代表了一种正在重塑抗体发现的新趋势。展望未来，这些方法与下一代计算工具的融合将加速跨传染病、肿瘤学及其他领域的创新治疗性抗体的开发。