Ex vivo和In vivo CAR-T路线的关键技术、核心差异及应用全流程梳理

2025-12-16 来源:本站点击次数:43

摘要
CAR-T 技术正从传统方式的“体外（ex vivo）编程”快速扩展到“体内（in vivo）直接编程”。前者已在血液肿瘤中确立疗效与标准流程，但存在制造复杂、成本高、可及性受限等瓶颈；后者责依托定向病毒载体或纳米递送核酸（mRNA/DNA）直接在患者体内改造免疫细胞，有望显著简化流程、降低成本并改善安全性与生物学特性。本文基于前沿综述与实践进展，系统梳理两条技术路线、关键环节、核心差异及应用场景，供研发与转化团队参考。

一、什么是CAR-T细胞治疗？
CAR‑T细胞疗法是指将患者外周血T细胞在体外（ex vivo）通过基因工程改造，使其表达能够特异识别肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体（CAR），经体外激活与扩增后回输体内，从而定向清除肿瘤细胞的一种治疗策略。

自2017年首批CAR‑T产品获批以来，全球CAR‑T市场持续快速扩张：2024年上半年销售额达到20.14亿美元，预计到2030年市场规模将增至218亿美元。

图1

CAR-T技术自诞生以来，也经历了数次迭代升级。CAR 结构从第一代到第五代的演变过程如下。所有五代 CAR 结构均包含四个共同结构域，分别是胞外抗原结合结构域、铰链区、跨膜区和胞内信号传导结构域。

CAR结构的演变.[1]

其功能区别如下表所示：

代次	核心结构特征	功能优势
第一代（1st）	仅含 1 个 CD3ζ 信号分子，无共刺激结构域	可实现基础的抗原识别与 T 细胞激活，结构最简单
第二代（2nd）	CD3ζ 信号分子 + 1 个共刺激结构域（CD28 或 4-1BB）	增强 T 细胞活化信号，提升 T 细胞增殖能力与存活时间
第三代（3rd）	CD3ζ 信号分子 + 2 个不同共刺激结构域（CD28-4-1BB 或 ICOS-4-1BB）	进一步强化信号传导，相比第二代更能增强 T 细胞的杀伤活性与持续性
第四代（4th）	含 CD3ζ、共刺激结构域 + 编码细胞因子（如 IL-12、IL-15）的基因序列	激活后可释放免疫刺激性细胞因子，提高 T 细胞在肿瘤组织中的浸润能力
第五代（5th）	含 TCR 激活信号、共刺激信号、细胞因子信号三个关键结构域（通用型 CAR）	实现接近生理状态的细胞因子信号传导，全面增强 T 细胞功能

二、Ex vivo和In vivo CAR-T路线的全流程梳理
1. 传统体外 CART（ex vivo）

患者筛选与转诊 → 白细胞分离（leukapheresis）→ T 细胞激活（CD3/CD28、细胞因子）→ 基因转导（常用慢病毒/γ逆转录病毒，或非病毒方法）→ 体外扩增与质控放行 → 回输前淋巴清除（环磷酰胺/氟达拉滨）→ 回输与监测

痛点与瓶颈

制造复杂、时间长（2–7周“静脉到静脉”周期），快速进展患者常需桥接治疗
个体化产品导致批间差异、产率波动及成本高昂
淋巴清除带来长期免疫细胞减少与感染风险
全流程对GMP产能、冷链与多点协同要求极高

2. 体内 CART（in vivo）

单一“即用型”制剂直接给药给患者，以体内存在的免疫细胞为基础，完成CAR 基因的在体导入与表达，形成活性CAR 细胞群

主要实现路径

ⅰ. 定向病毒载体：工程化慢病毒/逆转录病毒或 AAV，通过伪型化包膜/衣壳与外接靶向配体（scFv、纳米抗体、DARPin 等），在体内优先转导 T 细胞（CD3/CD4/CD8 等）
ⅱ. 非病毒纳米递送：脂质纳米颗粒（LNP）或可降解聚合物纳米颗粒（PBAE 等）递送 mRNA 或 DNA；并可通过抗体偶联（如抗 CD3/CD4/CD5/CD8）或脂质组成调控，增强对 T 细胞的摄取与表达

关键特征

ⅰ. 批量化、标准化“单一产品”，可储备并快速可及
ⅱ. 理论上可不依赖（或弱依赖）淋巴清除，保留完整免疫网络促进表位扩展
ⅲ. mRNA 方案多为短暂表达，可“可编程多次给药/剂量调控”，兼顾疗效与安全

体外及体内CAR-T治疗流程示意图[1]

三、In vivo CAR-T关键技术要点
1. 载体/递送系统与靶向策略
病毒载体

慢病毒：伪型化（如VSVG、麻疹、尼帕、辛德毕斯、cocal等）+ T 细胞靶向配体（antiCD3/CD4/CD8 的 scFv/DARPin），实现特异转导与膜融合进入；整合表达支持长期持续
AAV：衣壳表面展示靶向配体；以非整合表观遗传存在提供中长程表达

非病毒纳米递送

LNP：离子化阳离子脂质+辅脂（磷脂/胆固醇/PEG脂质）；通过内吞内体逃逸释放mRNA；可额外偶联抗体以增强 T 细胞摄取
聚合物纳米颗粒：可携带 mRNA 或 DNA；可通过多肽/抗体装饰提高特异性；可与转座子系统合用以实现持久表达（需格外注意安全性）
外泌体：工程化外泌体（例如树突状细胞来源外泌体），表面修饰抗 CD3/EGFR 抗体

递送载体

2. 核酸构建与表达动力学

mRNA 设计：加帽、优化UTR（常见α/βglobin 5′/3′UTR）、N1甲基伪尿苷修饰、Poly(A)长度等，综合提高稳定性与翻译效率并降低先天免疫识别
协同递送：可与siRNA（如PD1 siRNA）共递送以同步解除免疫抑制
表达时程：mRNALNP通常为短暂表达（数日级），适于“可重复给药 → 剂量/毒性实时调控 → 避免过度持续刺激引起衰竭”；DNA/整合型方案可延长表达，但插入突变与脱靶细胞转导风险需评估

3. 特异性与安全
脱靶转导/转染的后果

肿瘤细胞被转导可发生“表位遮蔽”（cis 结合导致抗原不可及）
抑制性免疫细胞（如Treg）被转导可能加剧疾病
生殖细胞/干细胞转导（病毒整合）存在生殖系/致癌风险

免疫原性与重复给药

LNP脂质本身的免疫刺激性、补体相关反应需管理（可借鉴已上市LNPsiRNA的预处理方案）
AAV/伪型包膜的既往免疫与中和抗体影响
mRNALNP的多次给药策略与免疫反应平衡

4. 工艺与剂量

给药途径：静脉优先；部分适应症考虑局部/腔内给药以提高局部暴露
剂量暴露应答关系：mRNA负载、LNP配方（脂质比例/粒径/表面化学）、UTR选择、靶向配体密度等共同决定体内T细胞阳转比例与表达持续时间
组合策略：多靶点并行（多mRNA或多载体序贯）、可诱导因子/合成细胞因子受体共表达等

四、体外与体内 CART 的差异与优缺点
研发/生产模式

体外：个体化定制，流程复杂、周期长、成本高但可严控产品属性
体内：单一批量化制剂，制造和放行流程大幅简化，快速可及、可及性强

免疫学与生物学

体外：需淋巴清除以促嵌合与扩增；体外扩增可能降低干性并诱导衰竭
体内：保留完整免疫微环境，利于表位扩展；mRNA短暂表达+分次给药可减轻持续刺激、降低CRS/ICANS风险并实现“剂量到效”

表达持久性

体外：整合型载体+扩增→长期持续
体内：mRNA 需重复给药；整合型病毒可长期，但对严格特异性和基因组安全提出更高要求

安全性侧重

体外：制品内源性/外源性突变克隆扩增监测、插入位点分析
体内：额外关注非靶细胞/生殖细胞转导、肿瘤细胞表位遮蔽、系统性免疫反应/过敏

适应症与场景

体外：已在 B 细胞恶性肿瘤中成熟
体内：对需要广覆盖与快速可及的疾病（如自身免疫、感染、纤维化）尤具吸引力；在肿瘤学中可作为快速桥接或与体外产品互补

五、应用版图与策略建议

血液肿瘤：体内整合型病毒或多次 mRNA 给药，取决于病情复发风险与需要的清除深度
自身免疫病：CD19/BCMA 等 B 细胞清除策略；mRNALNP更利于“低毒+可重复可调”的长期管理
感染疾病（如HIV、HBV研究中）：大规模可及、避免淋巴清除免疫低下的优势突出
纤维化/组织修复：短暂FAPCAR等在局灶组织内牵引免疫清除，配合心衰/肝纤维化等疾病早期干预

六、转化与监管关注要点

病毒载体：特异性转导证明、插入位点/克隆扩增长期随访、生殖系风险隔离
非病毒：配方一致性、mRNA质量与残留双链RNA控制、免疫安全评估与重复给药策略
CMC：放大工艺、批次一致性、冷链与可及性；体内制剂的质量属性（粒径/电荷/包封率/靶向偶联稳定性）需量化
伴随诊断：循环/组织中CAR细胞动力学、B细胞/肿瘤负荷监测、生物标志物（炎症细胞因子、神经毒性风险指标）

七、爱必信相关产品与服务
1. mRNA合成产品

货号	产品名称	规格
abs60690	T7 高产率RNA共转录试剂盒 (N1-Me-pUTP)	50T
abs60152	牛痘病毒加帽酶	500U/2000U/10000U
abs60153	T7 RNA 聚合酶	100KU/250KU
abs60166	2 氧甲基转移酶	2500U/10000U/50000U
abs60539	脱氧核糖核酸酶 I	1KU/5KU
abs60150	RNA酶抑制剂	250ul/1mL

mRNA定制服务
客户提供CDS序列 → 基因合成/质粒改造 → 模板制备线性化 → 体外转录 → 产物回收，质控交付

mRNA定制服务流程示意图

服务参数：

标准定制加帽方式：化学共转录法
标准定制帽结构：AbsCap AG
标准定制修饰碱基：N1-methyl-Pseudouridine-5'-Triphosphate
标准定制 UTR: Abs-CBT
最低合成量：100ug
标准质控：RNA完整性检测，RNA纯度胶图
标准定制合成周期：2-4周

注：
（1）定制化合成需客户提供CDS区的序列，交付终点为制备RNA。
（2）本定制化合成的UTR经过数百条序列验证，推荐使用，但不能保证RNA表达。
（3）图示中的signal peptide区仅为有分泌型的客户提示，如有分泌型需求，请提供信号肽序列。

2. 递送效率验证
工具mRNA+体外外转染试剂

货号	产品名称	规格
abs60339	mRNA转染试剂	1mL
abs60620	easyLNP™ mRNA免疫细胞转染试剂盒	1.5mL/3mL/5mL
abs60621	easyLNP™ Plus 通用型RNA细胞转染试剂盒	1.5mL/3mL/5mL
abs60622	easyLNP™ mRNA体内转染试剂盒（全身作用）	0.3mL/0.5mL/1mL
abs60623	easyLNP™ mRNA体内转染试剂盒（局部作用）	0.3mL/0.5mL/1mL
abs60174-A	Cas9 mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	100ug/100ug×5/100ug×10
abs60176-A	EGFP mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	100ug/100ug×5/100ug×10
abs60178-A	Fluc mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	100ug/100ug×5/100ug×10
abs60180-A	mcherry mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	100ug/100ug×5/100ug×10
abs60191-A	Cre mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	100ug/100ug×5/100ug×10
abs60312-A	OVA mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	100ug/100ug×5/100ug×10
abs60333	Endless Fluc mRNA	100ug
abs60332	Endless eGFP mRNA	100ug

3. 体内验证

货号	产品名称	规格	产品特点
abs42017259	D-荧光素钠盐	100mg/1g	体内转到效率及分布验证
abs42075819	D-荧光素钾盐	25mg/100mg/1g	体内转到效率及分布验证

4. 质控
病毒质控

货号	品名	规格	特点
abs590005	CHO细胞 HCP残留检测试剂盒	96T	检测CHO K1细胞HCP，高覆盖率抗体，特异性强，灵敏度高，检测下限低至3ng/ml
abs590016	E.coli表达菌HCP残留检测试剂盒	96T	检测E.coli BL21菌株HCP，高覆盖率抗体，特异性强，灵敏度高，检测下限低至1ng/ml
abs60544	宿主细胞残留DNA（磁珠法）样本前处理试剂盒	100T	通用性好(可提取多种HCD），方便快捷(支持手动&自动，1h完成)
abs60543	质粒DNA残留(qPCR)检测试剂盒	100T	搭配宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒使用；灵敏度高，线性范围300pg/µL~0.03pg/µL；精密度高：低浓度重复性CV值<20%；中高浓度重复性CV值<15%；线性标准：依据国标的基本要求，各项指标全，标准高，结果稳定可靠；快速高效：检测快速，一小时即可出结果
abs60545	HEK293残留DNA（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60546	293T细胞残留DNA（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60547	Human残留DNA（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60548	Hela细胞残留DNA（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60549	E1A残留DNA（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60550	E1A&SV40LTA残留DNA(qPCR)检测试剂盒	100T
abs60551	E.coli残留DNA（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60552	E.coli总RNA残留（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60553	CHO残留DNA（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60554	Vero残留DNA（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60555	毕赤酵母残留DNA（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60556	PG13残留DNA（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60557	HEK293残留DNA片段（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60558	293T细胞残留DNA片段（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60559	Human残留DNA片段（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60560	Hela细胞残留DNA片段（qPCR）检测试剂盒	100T
abs60561	Vero残留DNA片段（qPCR）检测试剂盒	100T

mRNA质控

货号	品名	规格	特点
abs590008	BSA残留检测试剂盒	96T	特异性强，不与其他种属反应；灵敏度高，最低可检测＜0.5ng/mL；准确性高，重复性好
abs590010	卡那霉素残留检测试剂盒	96T	灵敏度高，最低可检测＜0.05 ng/mL，准确性高，重复性好，两步竞争法，1h出结果方便快捷
abs590011	庆大霉素残留检测试剂盒	96T	灵敏度高，最低可检测＜0.05 ng/mL，准确性高，重复性好，两步竞争法，1h出结果方便快捷
abs590009	Protein A残留检测试剂盒	96T	灵敏度高，不惧高浓度IgG干扰
abs520031	RNase Inhibitor ELISA Kit	96T	夹心法ELISA，灵敏度高，重复性好（mRNA生产）
abs590015	T7 RNA聚合酶残留检测试剂盒（ELISA法）	96T	夹心法ELISA，灵敏度高，重复性好（mRNA生产）

污染物质控

货号	品名	规格	特点
abs9925	支原体检测试剂盒（qPCR法）	50T	检出率高：10CFU/mL口腔支原体、猪鼻支原体、肺炎支原体等各国药典提及的10种支原体标准菌株的检出率为100%。无假阳性，重复性好，CV值低于5%。
abs90283	MYCO-L™荧光素酶支原体检测试剂盒	10-50T	检测范围广，灵敏度与qPCR法相当，检测快速，30min可出结果
abs500001	重组 C 因子内毒素检测试剂盒	48T/96T	重组C因子替代传统鲎试剂，检测下限低至0.005EU/ml，药典方法

细胞因子质控

货号	品名	规格	特点
abs590014	dsRNA ELISA Kit	96T	特异性检测60bp以上dsRNA，与序列无关；支持多种修饰碱基dsRNA检测；灵敏度高，重复性好
abs560022	Human IL-2 Kit (HICA)	500-10000T	均相化学发光技术，免洗均相检测，化学发光，超宽线性范围，高灵敏度，快速
abs510028	Human IL-7 ELISA Kit	96T	传统夹心法ELISA，经典检测方法
abs510018	Human IL-15 ELISA Kit	96T	传统夹心法ELISA，经典检测方法
abs551810	Human IL-21 High Sensitivity ELISA Kit	96T	高敏ELISA，TSA信号放大，检测下限更低
abs50186	人十二项细胞因子检测试剂盒（流式荧光发光法）	48T/96T	CBA流式多因子检测，一份样本检测12个指标

流式功能验证质控

货号	产品名称	用途
abs930	人淋巴细胞分离液	PBMC收集
abs9518	大小鼠外周血淋巴细胞分离液
abs9101	红细胞裂解液（1×）
abs9475	固定剂	流式染色辅助试剂
abs9110	细胞染色缓冲液
abs9111	破膜剂

细胞治疗相关指标检测

货号	产品名称	具体作用	应用分类
abs510007	Human IFN-γ ELISA Kit	细胞免疫主导，抗胞内病原体与肿瘤。	Th1型反应标志(细胞免疫主导，抗胞内病原体/肿瘤)
abs551162	Human IL-12 ELISA Kit	促进 Th1 细胞分化，增强细胞免疫功能，抗胞内病原体与肿瘤。
abs510012	Human IL-12p70 ELISA Kit	促进 Th1 细胞分化，增强细胞免疫功能，抗胞内病原体与肿瘤。
abs510004	Human IL-8/CXCL8 ELISA Kit	协同 IL-12 增强 NK 细胞功能，促进 Th1 细胞分化，参与细胞免疫反应。
abs551124	Human IL-18 ELISA Kit	协同 IL-12 增强 NK 细胞功能，促进 Th1 细胞分化，参与细胞免疫反应。
abs5510734	Human CXCL9/MIG ELISA Kit	趋化免疫细胞，参与 Th1 型免疫应答，抗胞内病原体与肿瘤。
abs510027	Human CXCL10/IP-10 ELISA Kit	趋化免疫细胞，参与 Th1 型免疫应答，抗胞内病原体与肿瘤。
abs551855	Human TNF-b ELISA Kit	调节免疫细胞功能，参与细胞免疫反应，抗胞内病原体与肿瘤。
abs560032	Human IFN-γ Kit (HICA)	细胞免疫主导，抗胞内病原体与肿瘤。
abs560029	Human IL-12p70 Kit (HICA)	促进 Th1 细胞分化，增强细胞免疫功能，抗胞内病原体与肿瘤。
abs560026	Human IL-8 Kit (HICA)	协同 IL-12 增强 NK 细胞功能，促进 Th1 细胞分化，参与细胞免疫反应。
abs560036	Human TNF-β Kit (HICA)	调节免疫细胞功能，参与细胞免疫反应，抗胞内病原体与肿瘤。
abs510017	Human IL-4 ELISA Kit	体液免疫主导，抗寄生虫，介导过敏反应。	Th2型反应标志(体液免疫主导，抗寄生虫，过敏反应)
abs551003	Human IL-5 ELISA Kit	促进嗜酸性粒细胞增殖与分化，参与抗寄生虫免疫和过敏反应。
abs551004	Human IL-9 ELISA Kit	参与 Th2 细胞介导的免疫反应，如过敏反应。
abs510016	Human IL-13 ELISA Kit	调节体液免疫，参与抗寄生虫免疫和过敏反应。
abs560024	Human IL-5 Kit (HICA)	促进嗜酸性粒细胞增殖与分化，参与抗寄生虫免疫和过敏反应。
abs510003	Human IL-6 ELISA Kit	抗胞外菌 / 真菌，参与自身免疫和炎症反应。	Th17型反应标志(抗胞外菌/真菌，参与自身免疫/炎症)
abs510019	Human IL-17/IL-17A ELISA Kit	招募中性粒细胞，抗胞外病原体，参与炎症和自身免疫疾病。
abs510020	Human IL-22 ELISA Kit	维持上皮屏障功能，抗胞外病原体，参与炎症反应。
abs510013	Human IL-23 ELISA Kit	维持 Th17 细胞稳定性，参与炎症和自身免疫反应。
abs560025	Human IL-6 Kit (HICA)	抗胞外菌 / 真菌，参与自身免疫和炎症反应。
abs510005	Human IL-10 ELISA Kit	维持免疫耐受，抑制免疫反应。	调节性T细胞 (Treg) 反应标志(维持免疫耐受，抑制免疫反应)
abs510032	Human TGF-β1 ELISA Kit	调节免疫细胞功能，抑制免疫反应，维持免疫稳态。
abs5510126	Human FOXP3 ELISA Kit	Treg 细胞特异性标志物，评估 Treg 细胞数量与功能。
abs551193	Human LAG3 ELISA Kit	参与免疫抑制，调节 T 细胞活化，维持免疫耐受。
abs5510648	Human sCTLA-4 ELISA Kit
abs5510649	Human CTLA4 ELISA Kit
abs560027	Human IL-10 Kit (HICA)	维持免疫耐受，抑制免疫反应。

参考文献：
1. Huang Y, Cao R, Wang S, Chen X, Ping Y, Zhang Y. In vivo CAR-T cell therapy: New breakthroughs for cell-based tumor immunotherapy. Hum Vaccin Immunother. 2025 Dec;21(1):2558403. doi: 10.1080/21645515.2025.2558403.

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