荧光法检测PCR效率的方法和步骤（以标准曲线法为核心）
2025-12-18 来源:本站 点击次数:44
荧光定量PCR（qPCR）中的“扩增效率”指的是每个PCR循环中目标DNA片段被成功复制的比例。理论上为100%（即每个循环拷贝数翻倍），但实际受酶活性、引物设计、模板质量等因素影响而降低。准确评估该效率对确保定量结果可靠至关重要。
检测步骤与方法（以标准曲线法为核心）
1、准备标准品：
使用已知浓度的目标DNA或cDNA作为阳性模板。
将其进行系列梯度稀释（通常为5-7个点），常见为10倍连续稀释（如10⁴, 105, 106, 107, 108 copies/μL）。部分方案也使用5倍稀释。
2、运行qPCR反应：
将不同浓度的标准品与待测样本一同放入qPCR仪中进行扩增。
确保所有反应孔的体系一致（除模板浓度外）。
3、获取Ct值：
qPCR仪器会实时监测荧光信号。当信号强度超过预设阈值时，所对应的循环数即为Ct值（或Cq值）。
记录每个稀释梯度标准品的Ct值。
绘制标准曲线并计算效率
以标准品的起始浓度的对数值（log10Concentration）为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，绘制散点图并进行线性回归，得到一条直线。
根据公式计算扩增效率（E）： E = (10^(-1/slope) - 1) × 100%
理想情况下，100%扩增效率对应的斜率为-3.32。一般认为斜率在-3.1至-3.6之间，扩增效率在90%-110%范围内均可接受。
下表总结了判断扩增效率的关键指标：
现代qPCR仪器和配套软件通常能自动完成标准曲线的绘制和扩增效率的计算，用户只需输入标准品浓度即可。
建议
进行扩增效率检测是验证qPCR实验系统有效性的关键质控步骤。建议在建立新引物对或更换试剂批次时都进行此项测试，以确保后续定量结果的准确性。
检测步骤与方法（以标准曲线法为核心）
1、准备标准品：
使用已知浓度的目标DNA或cDNA作为阳性模板。
将其进行系列梯度稀释（通常为5-7个点），常见为10倍连续稀释（如10⁴, 105, 106, 107, 108 copies/μL）。部分方案也使用5倍稀释。
2、运行qPCR反应：
将不同浓度的标准品与待测样本一同放入qPCR仪中进行扩增。
确保所有反应孔的体系一致（除模板浓度外）。
3、获取Ct值：
qPCR仪器会实时监测荧光信号。当信号强度超过预设阈值时，所对应的循环数即为Ct值（或Cq值）。
记录每个稀释梯度标准品的Ct值。
绘制标准曲线并计算效率
以标准品的起始浓度的对数值（log10Concentration）为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，绘制散点图并进行线性回归，得到一条直线。
根据公式计算扩增效率（E）： E = (10^(-1/slope) - 1) × 100%
理想情况下，100%扩增效率对应的斜率为-3.32。一般认为斜率在-3.1至-3.6之间，扩增效率在90%-110%范围内均可接受。
下表总结了判断扩增效率的关键指标：
| 判断指标 | 理想值 | 可接受范围 | 说明 |
| 标准曲线斜率 (Slope) | -3.32 | -3.1 至 -3.6 | 斜率越接近-3.32，效率越接近100% |
| 扩增效率 (Efficiency, E) | 100% | 90% - 110% | 由斜率换算得出，反映每个循环的产物增长比例 |
| 相关系数 (R²) | >0.99 | >0.98 | 反映数据点与标准曲线的拟合程度，越高越好 |
现代qPCR仪器和配套软件通常能自动完成标准曲线的绘制和扩增效率的计算，用户只需输入标准品浓度即可。
建议
进行扩增效率检测是验证qPCR实验系统有效性的关键质控步骤。建议在建立新引物对或更换试剂批次时都进行此项测试，以确保后续定量结果的准确性。
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