荧光法PCR效率检测的操作流程及细节分析
2025-12-18 来源:本站 点击次数:54
在荧光定量PCR（qPCR）实验中，扩增效率直接影响Ct值与起始模板量之间的线性关系。若效率偏低或偏高，会导致定量偏差，尤其在相对定量（如ΔΔCt法）分析中影响显著。因此，在正式实验前验证引物或探针的扩增效率至关重要。
操作流程与关键细节
1.模板准备：梯度稀释
使用高质量、浓度已知的cDNA或DNA模板。
进行连续梯度稀释（通常为5倍或10倍稀释），建议至少5个稀释点，覆盖预期检测范围。
示例：将cDNA原液稀释为1:5、1:25、1:125、1:625、1:3125等。
2.反应体系配制
在同一块96孔板上运行所有稀释样本及阴性对照（无模板对照NTC）。
推荐使用预混液（如SYBR Green Master Mix），减少加样误差。
保证每孔反应体积一致（常见为10–20 μL），充分混匀后短暂离心去除气泡。
3.仪器程序设置
根据引物Tm值设定退火温度，可采用三步法（变性→退火→延伸）或两步法（合并退火/延伸）。
确保荧光信号采集步骤正确设置（如SYBR法选择FAM通道，淬灭选None）
示例循环参数：
预变性：95°C，10 min
扩增循环（40 cycles）：
变性：95°C，15 sec
退火：60°C，30–60 sec（含荧光采集）
延伸：72°C，30 sec（可选）
4. 数据分析：标准曲线与效率计算
补充说明：扩增效率接近100%时，每个循环产物翻倍，对应斜率为-3.32。偏离此值表明存在抑制物、引物二聚体或非特异性扩增等问题。
5.结果判断与优化
若效率不在90–105%之间，需排查以下因素：
引物设计不合理（GC含量、Tm值差异大、形成二聚体）
模板质量差（降解、残留乙醇或盐离子）
反应条件未优化（退火温度不当）
可尝试调整Mg²⁺浓度、退火温度或重新设计引物。
建议
每次更换引物、试剂批次或样本类型前，都应重新进行扩增效率检测。对于高精度研究（如基因表达差异微小），必须报告扩增效率以增强结果可信度。
操作流程与关键细节
1.模板准备：梯度稀释
使用高质量、浓度已知的cDNA或DNA模板。
进行连续梯度稀释（通常为5倍或10倍稀释），建议至少5个稀释点，覆盖预期检测范围。
示例：将cDNA原液稀释为1:5、1:25、1:125、1:625、1:3125等。
2.反应体系配制
在同一块96孔板上运行所有稀释样本及阴性对照（无模板对照NTC）。
推荐使用预混液（如SYBR Green Master Mix），减少加样误差。
保证每孔反应体积一致（常见为10–20 μL），充分混匀后短暂离心去除气泡。
3.仪器程序设置
根据引物Tm值设定退火温度，可采用三步法（变性→退火→延伸）或两步法（合并退火/延伸）。
确保荧光信号采集步骤正确设置（如SYBR法选择FAM通道，淬灭选None）
示例循环参数：
预变性：95°C，10 min
扩增循环（40 cycles）：
变性：95°C，15 sec
退火：60°C，30–60 sec（含荧光采集）
延伸：72°C，30 sec（可选）
4. 数据分析：标准曲线与效率计算
| 参数 | 计算方式 | 理想范围 |
| 标准曲线斜率 (Slope) | 由软件自动生成 | -3.1 到 -3.6 |
| 扩增效率 (E) | E = (10^(-1/slope) - 1) × 100% | 90%–105% |
| 相关系数 (R2) | 衡量数据点拟合度 | >0.99 |
5.结果判断与优化
若效率不在90–105%之间，需排查以下因素：
引物设计不合理（GC含量、Tm值差异大、形成二聚体）
模板质量差（降解、残留乙醇或盐离子）
反应条件未优化（退火温度不当）
可尝试调整Mg²⁺浓度、退火温度或重新设计引物。
建议
每次更换引物、试剂批次或样本类型前，都应重新进行扩增效率检测。对于高精度研究（如基因表达差异微小），必须报告扩增效率以增强结果可信度。
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