显微课堂：选择科研级显微镜时需要考虑的因素
2025-12-18 来源:徕卡显微镜 点击次数:24
光学显微镜通常是生命科学研究实验室中的核心设备之一。它可以用于各种应用，揭示许多科学问题。因此，显微镜的配置和特征对其应用范围至关重要，从明场显微镜到荧光显微镜，再到活细胞成像。
本文提供了相关显微镜特征的简要概述，并总结了选择科研级显微镜时应考虑的关键问题。
你使用什么样的标本？
选择科研级显微镜时要考虑的首要事项之一是你想要探索的标本类型。对于固定在薄玻璃载玻片上的样本，可以使用立式显微镜。活细胞对显微镜有特殊要求，因为它们被放置在相对较大的细胞培养容器中，里面装有细胞培养基。
图 1：左：用于安装固定样本（例如组织切片）的玻璃载玻片。右：用于细胞培养的培养皿。
只有倒置配置，即物镜在标本下方，冷凝器在标本上方，才能提供必要的自由空间和物镜与标本的所需接近度。同时，倒置显微镜保持了对细胞的良好可及性，例如添加微操纵器。
此外，活细胞需要适当的环境才能生存。温度和 CO2 浓度必须保持在一定水平。一个气候箱及相应的控制器是完成此任务所必需的。
图 2：左：直立显微镜的物镜在标本上方，冷凝器在标本下方。右：在倒置显微镜中，这种设置被反转，给用户提供了更多空间以及物镜与标本的所需接近度。
你认为在什么维度上？
显微镜标本扩展到三个维度：长度、宽度和高度。虽然一些标本，如组织切片，仅在 xy 方向成像，但还有其他应用需要在 z 维度上进行采集。为了成像例如活细胞的 3D 体积，建议使用能够逐步引导样本通过焦点的电动物镜转盘。成像软件应能够重建单个图像以进行 3D 可视化。
对于活细胞，您必须添加时间维度。在这种情况下，例如系统 稳定性 是另一个关键特征。由于温度变化会影响成像系统在采集过程中的表现，因此有效的对策至关重要。自动对焦调整，例如 自适应焦点控制 (AFC)，可以抵消这些热影响，并始终找到预定义的焦点。
图 3：自适应焦点控制（AFC）在长期时间延迟采集过程中自动稳定显微镜的焦点。传感器检测 LED 光束（850 nm）的移动，当承载样本的盖玻片因热活动等原因改变位置时，会发生这种移动。
哪种对比方法最适合您的样本？
大多数细胞——尤其是动物细胞——在显微镜下观察时没有足够的内在对比度来看到细节。研究人员使用 对比方法 来解决这个问题。虽然相位对比 (PH) 和差分干涉对比 (DIC) 操控通过标本的光线以增加对比度，但您也可以用荧光染料 （如何准备您的标本以进行免疫荧光显微镜观察）进行染色，或者使用荧光蛋白。
根据对比方法，显微镜需要特定的设备；例如，相位对比需要特殊的物镜，而 DIC 则利用某些 棱镜，这些棱镜必须切换到光路中。对于荧光显微镜，您需要特殊的滤光块，以允许正确的光波长进入和离开标本。
图 4：采用不同对比方法获得的一系列神经细胞。从左到右：明场，DIC，相位对比，荧光
光源怎么样呢？
对比方法的选择也决定了光源。传统明场显微镜、相位对比和 DIC 的透射光照明可以使用 卤素或 LED 照明。荧光显微镜可以使用 LED 照明或借助 汞、氙或汞金属卤化物灯进行。
你想记录或发布你的结果吗？
如果你想拍摄你的标本或进行活细胞成像，你需要一个数字显微镜相机。特别是在荧光活细胞成像的情况下，建议使用灵敏的相机，以最小化可能对细胞造成伤害的激发光量。除了成熟的CCD和EMDDC相机外，如今 sCMOS 相机因其高量子效率和采集速度而受到欢迎。有关数字显微镜相机的更多信息，请阅读文章《数字相机技术简介》。
此外，较大的 视野 (FOV) 有助于更快地找到有趣的区域，并同时成像更多的细胞。现代研究显微镜在相机端口配备了 19 毫米视野，与 19 毫米 sCMOS 相机芯片完美匹配。
19 毫米视场的优势
通常，仅仅拍摄样本的图像是不够的，还需要对您获得的数据进行分析。为此，易于使用的 成像和分析软件 有助于获取定量数据并进行可靠的数据分析。
你需要来自厚样本的（3D）信息吗？
厚样本对显微镜观察来说是一个挑战。尤其是在宽场显微镜中，整个样本同时被照明，识别处于焦点的样本特征可能会因来自失焦区域的额外光线而显著降低。
Computational Clearing可以帮助获得不受失焦光影响的图像。该技术可以应用于单个图像平面以获得即时结果（ICC：即时Computational Clearing），或者可以与额外的去卷积步骤结合使用（SVCC：小体积Computational Clearing；LVCC：大体积Computational Clearing），以获得更好的结果。去卷积将光子信息重新分配到其来源，从而提供更好的焦平面中所需结构的对比度。这可以使用户更容易区分感兴趣的结构与背景，而不是使用传统的宽场图像。
图 5：癌组织中的单分子 RNA-FISH。RNA-01（绿色），RNA-02（品红色）左：原始数据。中：使用即时Computational Clearing。右：经过大体积Computational Clearing处理。瑞士苏黎世大学安德烈亚斯·摩尔教授提供。
你想在显微镜下操作你的细胞吗？
在过去几年中，样本的照片处理变得流行。这意味着研究人员不仅观察活细胞，还借助光来操控它们。光漂白后的荧光恢复（FRAP）就是一个有助于理清动态细胞过程的例子。对于这些操控技术，通常需要额外的光源，这些光源必须集成到显微镜的光路中。
这种方法并不简单。徕卡无限端口是一种通用解决方案，可以将额外的光源耦合到显微镜的光路中，而不影响图像质量，以进行例如 FRAP、光切换、消融或光遗传学。只要有合适的适配器，研究人员甚至可以耦合他们自制的设备。
图 6：徕卡 WF FRAP模块（左侧的黑箱）可以通过无限端口与倒置研究显微镜徕卡 DMi8 连接。
你的预算是多少？
一个重要的问题是你能花多少钱。一些显微镜供应商提供适合特定应用的预定义配置。但是，如果你不需要你所支付的所有预配置组件呢？这就是为什么自由配置的组件可能比购买预定义显微镜系统更便宜。
此外，显微镜的要求可能会随着时间而变化。在这种情况下，可升级系统具有一定的优势。使用预定义和固定配置，你可能会发现自己被限制在有限的应用范围内。可升级性让你有自由随着需求的变化而成长。
考虑到这些因素，像徕卡显微系统DMi8 这样的模块化显微镜平台使研究人员能够从一个负担得起的显微镜系统开始，之后可以进行升级，以满足他的需求
图 7：得益于其模块化设计，徕卡 DMi8 可以根据研究人员的需求进行配置。此外，如果需求发生变化，它还可以在后期进行升级。
谁会使用显微镜？
显微镜用户的范围可以非常不均匀。尤其在大学，用户可能非常有经验或是完全的初学者。因此，使用由直观软件驱动的易用显微镜系统，例如徕卡显微系统应用套件 X（LAS X），有助于快速入门并迅速获取数据。例如，面向工作流程的设计、图像分析向导以及外设的无缝集成简化了您的工作。
除了宽场科研级显微镜，体视显微镜在生命科学研究实验室中也经常使用。有关更多信息，请参阅文章“选择体视显微镜时需要考虑的因素”。
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