文章来源公众号：戴草帽的渔夫               作者：戴草帽的渔夫

SDE-100是靶点为CD25特异性抗体药物偶联物（ADC）。白血病患者体内的癌变白细胞表
高表达CD25。生物学活性选用了人非霍奇金大细胞淋巴瘤细胞Karpass 299细胞系，该细胞系细胞膜表面高表达CD25。

在进行细胞实验之前，对细胞进行了4周时间的培养，监测其生长速率，以确定细胞倍增时间。这个步骤非常关键，因为用于偶联抗体的小分子毒素MMAE与微管蛋白的相互作用只有在细胞分裂或尝试分裂时才会导致细胞死亡。

研究表明，Karpass 299细胞的倍增时间约为30小时，且需要大约三次倍增才能使活细胞和死细胞之间产生显著差异，从而便于在检测中识别。因此，该细胞的培养时间可为检测方法开发的早期阶段确定药物与细胞的初始孵育时间提供参考。

在细胞培养初期，该团队建立了两级细胞库，一个主细胞库和两个工作细胞库。通过使用工作细胞库，能够确保所有实验均使用同一代细胞，从而降低细胞间的变异性。

细胞生物活性测定
1.将Karpass 299细胞接种于96孔板中，使其分布均匀。药物以浓度梯度的形式加入到96孔板中，高浓度位于孔板顶部，低浓度位于孔板底部，细胞与药物共同孵育5天；

2.取出孵育5天的96孔板，加入MTS检测试剂。MTS为一种四唑化合物，其检测原理为黄色的MTS在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NA）存在下会被还原成蓝紫色的甲臜，NADPH用于检测活细胞，死细胞显示黄色，活细胞孔则为蓝色。在加入MTS孵育3小时后，观测到孔板内颜色从黄色逐渐变为蓝色（由上而下），颜色变化与药物浓度呈正相关；

3.用酶标仪读取OD490 nm吸收光，OD值高表示活细胞数量多，OD值低表示死细胞数量多。结果见图1：

ADC SDE-100的方法开发
开发检测方法时，首先需要研究抗体及其抗体药物偶联物（ADC）的各种作用机制。
1）抗体与靶点结合可能产生细胞毒性作用，例如通过抑制生长因子受体的二聚化和激活
2）抗体的可结晶片段（FC）尾部也可能通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性吞噬作用（ADP）或补体依赖性细胞毒性（CDC）募集免疫系统的细胞毒性成分。

在抗体药物偶联物（ADC）中，除了药物介导的细胞毒性外，还可能诱导产生这些细胞毒性效应。因此，可能需要开发一系列基于细胞的检测方法，例如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）或细胞毒性（CDC）检测，以测试ADC的各种作用机制，尤其是在单克隆抗体被证实具有治疗作用的情况下，必须确定将该抗体与细胞毒素连接不会改变或消除其治疗作用机制。

评估细胞内MMAE激活导致细胞凋亡
评估特定抗体偶联药物（ADC）及其靶细胞类型的相关文献，不仅是明确其多重作用机制的必要途径，更为测定方法开发初期的起始条件设定提供了重要依据。

开发细胞检测方法时，需要克服的一个重要挑战是生物学变异。细胞系之间的变异来源包括细胞倍增时间、细胞表面抗原密度、毒素敏感性和接种密度。因此，在开发新的检测方法时，优化孵育时间、细胞暴露于药物的时间、细胞密度以及药物浓度范围至关重要。明确定义最终效力曲线的特征也至关重要。表1列出了方法开发所需效价曲线的特征，主要表现为3个特征：

1）数据点本身必须定义一条曲线，该曲线具有四个参数，分别为上渐近线、下渐近线、线性部分以及易于定义的EC50至少应有三个点；

2）上下渐近线之间的倍数响应差异，应该能够用四参数逻辑模型拟合数据，且R平方值大于 0.95，表明原始数据与模型拟合良好；

3）为了确保样品和参比物与细胞的相互作用方式相同，各自效价曲线的线性部分必须平行，这种平行性可通过目测和曲线的统计分析来验证。影响这些特征的检测参数主要有药物浓度系列、药物孵育时间和细胞接种密度。

表1 所需效价曲线的特征

图2显示在初始细胞密度和孵育时间固定的情况下，对细胞加入不同药物浓度系列的试验结果。该试验证明了想要开发的检测方法是可行的。此外，该实验还确定了适用于后续开发步骤的合适药物浓度系列。图中曲线呈现出良好的 S 形，具有相当清晰的上渐近线、线性区域和下渐近线。

图3显示了不同孵育时间和细胞密度的影响。左图和右图分别是孵育5天和6天，不同细胞密度、相同药物浓度的结果；与孵育5天相比，孵育6天后效力曲线的质量有所下降。

原因可能是因为孵育6天有大量细胞死亡，导致难以在检测中区分活细胞和死细胞。所以，确定孵育5天被认为是获得高质量效力曲线的最佳时间。

对孵育5天时间的曲线进行统计分析，以确定哪条曲线质量最佳。接下来重点关注每条曲线的R平方值，以确定哪条曲线最能拟合相应的数据。

对5天培养曲线的分析，红色曲线展现出最佳的R²值，R²值最接近于1，且AD比值最高。在此基础上，进一步优化了浓度系列和细胞密度，最终生成了用于预验证的最终检测方法。

在报告结果时未对每个样品进行绝对效价值报，而是每次测定中都会加入一个参考品，以相对效价作为报告结果。

图4蓝色为参考品、紫色为对照样品，对照样品与参考品曲线完全重合，根据曲线的偏倚情况可以看出左图中低DAR值样品与右图的高DAR样品相比，高DAR值样品具有较高的活性值。

区分高DAR和低DAR样品是ADC效力测定中的另一个重要指标，因为ADC的作用机制是内化和随后的毒素释放，如果检测方法对DAR不敏感，则ADC未能杀死细胞的机制以及该检测方法是否适合作为体内药物活性的模型都会受到质疑。

细胞活性分析方法验证
方法验证按照ICH指南进行，图5显示了该检测方法的线性度和范围结果，其线性度与标称值之间存在统计学意义上的显著相关性，相对效价均在50%～200%之间（相对值）。

表2为方法验证的验收标准，结果显示所有数据点的准确度和精密度均在50%～200%之间，通过了验收标准，判定该检测方法的有效范围为50%～200%。

评估的准确性是通过计算相对偏差来确定的，相对偏差是将特定评估的名义效力与观察到的效力进行比较。

评估测定中最大的相对偏差百分比为3.3%。观察到评估结果为141%，比预期高3.3%。

重复性是通过测量在同一次运行中进行的6次100%评估的相对标准偏差(RSD)来确定的，结果为3.9%；

中间精密度通过四次评估确定，每次评估分两次进行，由不同的分析员使用不同批次的胎牛血清作为培养基，并在不同的日期进行。相对标准偏差（RSD）为4.5%；

通过比较使用两个不同的细胞库进行评估的相对偏差来确定稳健性，最大相对偏差百分比为5.6%；

结果表明，考察评估准确性、一次运行内的变异性、运行间的变异性以及不同细胞库之间的变异性，所有结果均通过了方法验证的验收标准。

系统适用性标准，效价曲线的r平方值、每种药物浓度下三个重复测量的精密度、AD 比率以及用于确定相对效价的样品曲线和参考曲线的平行性。这些系统适用性标准符合验证阶段设定的验收标准，并随后被纳入样品测试的数据分析中。使用经验证的检测方法生成的数据必须满足这些系统适用性标准才能被接受。

图6通过比较ADC SDE‑100的相对效力与单克隆抗体 HuMax‑TAC和NAC淬灭毒素连接子vcMMAE的相对效力，检测了该方法的特异性。