超分辨率荧光显微镜技术为细胞级超分辨率成像提供了新工具
2025-12-22 来源:本站 点击次数:262该论文聚焦于超分辨率荧光显微镜技术，特别针对4Pi单分子定位显微镜（4Pi-SMSN）系统，提出了一种新型定位算法PR-4Pi。该算法结合相干瞳孔函数建模和光片照明技术，显著提升了三维分辨率，实现了理论信息极限的定位精度。研究通过实验验证，在复杂生物样本如线粒体蛋白成像中，展示了分辨率的全面提升，为细胞级超分辨率成像提供了新工具。
重要发现者包括Sheng Liu和Fang Huang，其成果以《Enhanced 4Pi single-molecule localization microscopy with coherent pupil based localization and light sheet illumination》为题。
重要发现
01PR-4Pi定位算法的核心贡献
论文的核心创新在于开发了PR-4Pi（Phase-Retrieved 4Pi）定位算法，该算法基于相干瞳孔函数来建模4Pi系统的点扩散函数（PSF）。传统4Pi显微镜利用双物镜干涉检测，生成复杂的干涉PSF模式，但以往方法仅利用中心瓣信息，丢弃了大量侧瓣光子，导致信息损失。PR-4Pi算法通过相位检索技术，独立获取上下干涉路径的瞳孔函数，从而准确模拟包含像差、传输损失和部分相干性的真实PSF。这一模型允许使用最大似然估计器（MLE）提取单分子位置，达到Fisher信息理论预测的Cramér-Rao下界（CRLB），即理论极限定位精度。
基于相干、相位恢复光瞳的4Pi-PSF模型
实验过程中，研究团队首先通过成像100纳米荧光珠标定系统，比较了PR-4PiPSF模型与理想PSF模型。结果显示，PR-4Pi模型与实验PSF的交叉相关性高达0.9以上，而理想模型在离焦区域相关性显著下降，验证了PR-4Pi的准确性。进一步，在单分子定位测试中，PR-4Pi算法在低光子计数（约600光子/物镜）条件下，实现了轴向定位精度达3-6纳米，横向精度达4-18纳米，较传统对比度方法提升1-4倍，且偏差降低2-6倍。
02腔相位漂移的动态校正技术4Pi系统的一个独特挑战是腔相位漂移，即由温度波动引起的光路长度变化，会导致PSF模式快速变形。论文发现，每秒0.04弧度的漂移在10秒内就会引起约18纳米的轴向分辨率劣化。PR-4Pi算法通过短时数据批处理（每10秒），校准腔相位φ0，并利用样条插值生成时间依赖的PSF模型，实现动态补偿。在细胞成像中，该方法将轴向漂移控制在5纳米以内，避免了图像伪影。对于多光学层析成像，算法还考虑了样本扫描引入的相位变化，通过公式φd=4πn_imm d N_step/λ0 (1-n_med²/n_imm²)进行校正，确保全细胞体积成像的连续性。
03光片照明技术的背景抑制
为减少荧光背景，论文开发了4Pi兼容的高倾斜光片（Hi-LS）照明方法。传统epi照明在厚样本中产生高背景（约85光子），而Hi-LS通过分光路径，在上物镜使用epi照明定位区域，下物镜生成倾斜光片（厚度约2.3微米），将背景降低至15光子，降幅超5倍。理论计算显示，背景减少可提升定位精度1.4-1.7倍。在COS-7细胞的TOM20蛋白成像中，Hi-LS结合PR-4Pi算法，使聚类结构更清晰，轴向定位范围扩展至1.4微米，分辨率在三维维度均得到增强。
COS-7细胞中线粒体（TOM20）单平面成像的SMSN重建
04实验验证与生物成像应用在生物样本验证中，研究对免疫标记的COS-7细胞线粒体蛋白TOM20进行成像。单光学层析数据使用160个时间依赖的PR-4PiPSF模型，多层层析使用240个模型，结果显示PR-4Pi算法能更精确对齐光学层，聚类亮度更高，定位接受率提升。与对比度方法相比，PR-4Pi在横向和轴向均能解析亚百纳米结构，如线粒体膜蛋白的紧密排列。此外，算法通过鬼影减少程序，将伪定位比例控制在2%以下，提升了重建可靠性。
创新与亮点
01突破复杂PSF信息利用难题
论文的核心突破在于解决了4Pi-PSF复杂模式的信息提取难题。传统方法忽略干涉条纹，仅用高斯掩模或中心矩处理，导致信息利用率不足50%。PR-4Pi算法通过像素级Fisher信息分析，揭示干涉PSF在轴向和横向上信息量提升20-160倍和4-7倍，从而首次实现全模式信息利用。这一创新使系统在低信噪比下仍保持高精度，突破了干涉显微镜长期存在的“信息浪费”瓶颈。
02新成像技术集成
技术亮点包括相干瞳孔建模与光片照明的协同创新。PR-4Pi算法不仅建模静态像差，还引入部分相干性因子（a≈0.8）和强度比（It=1），使PSF模型在样本深度变化时保持稳定。光片照明设计通过圆柱透镜和扫描镜调控，实现大视野（22×8微米²）下的薄层激发，较传统HILO照明厚度减少3倍。这种集成技术将光学系统的理论优势转化为实际成像增益，为活细胞动态研究奠定基础。
在光学生物医疗领域，该技术提升了超分辨率成像的实用性和可及性。通过实现10-15纳米各向同性分辨率，PR-4Pi系统能解析细胞器如线粒体的纳米级结构动态，有望应用于病理研究如神经退行性疾病中的蛋白聚集观测。此外，算法开源和动态校正设计降低了系统运维成本，使干涉显微镜更易推广至临床前研究。
总结与展望
本研究通过PR-4Pi算法和光片照明技术，显著提升了4Pi单分子定位显微镜的分辨率和鲁棒性。论文不仅实现了理论信息极限的定位精度，还解决了腔相位漂移和背景噪声等实际问题，在生物成像中展示了亚细胞结构的高清可视化。未来，该技术可进一步结合深度学习优化PSF建模，拓展至多色标记和活体成像场景，推动超分辨率显微镜在精准医疗和细胞生物学中的广泛应用。同时，开源代码的发布将促进技术迭代，助力光学成像领域的新突破。
声明：本文仅用作学术目的。
Liu S, Huang F. Enhanced 4Pi single-molecule localization microscopy with coherent pupil based localization. Commun Biol. 2020 May 8;3(1):220. doi: 10.1038/s42003-020-0908-2. Erratum in: Commun Biol. 2020 May 29;3(1):280.
DOI:10.1038/s42003-020-1020-3.