PCR试剂盒的标准操作流程详解
2025-12-24 来源:本站 点击次数:391
PCR试剂盒是分子生物学和临床检测中用于扩增特定DNA或RNA序列的关键工具，广泛应用于病原体检测（如病毒、细菌）、基因表达分析和遗传诊断等领域。其工作原理基于聚合酶链式反应（PCR），通过特异性引物和探针识别目标序列，结合荧光定量技术实现快速、高灵敏度的定性或定量检测。为保证实验成功，必须在专用分区实验室中进行，并严格执行防污染措施 。
操作步骤详解
以下是关于PCR试剂盒的标准操作流程：
一、实验前准备
分区操作：实验应在独立的试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行，各区的实验服、仪器和耗材不得混用。
设备检查：校准移液器，准备冰盒（非热启动酶需全程低温操作），检查PCR仪、离心机等设备状态，并对超净台进行紫外消毒15分钟。
试剂处理：所有试剂在使用前应于室温充分融化并震荡混匀，随后瞬时离心以去除气泡。
二、反应体系配制
三、样本与对照加入
注意：阳性对照应在标本准备区单独存放并在最后加入，防止污染。
四、上机扩增
盖紧管盖，在右上角做好标记；
放入PCR仪前震荡混匀并瞬时离心；
打开荧光定量PCR仪及其连接电脑；
设置程序（见下表）；
将PCR板放入仪器卡槽，关闭盖子；
启动运行。
典型PCR程序设置示例：
注：具体参数需根据试剂盒说明书设定，不同靶标可能略有差异。
结果判读与数据分析
实验结束后，仪器自动生成扩增曲线和Ct值；
观察扩增曲线是否呈典型“S”形，判断扩增效率；
根据Ct值判断目标核酸含量——Ct值越低，初始模板量越高；
结合阴性和阳性对照结果进行综合判定，排除假阳/假阴性。
✅ 建议
操作步骤详解
以下是关于PCR试剂盒的标准操作流程：
一、实验前准备
分区操作：实验应在独立的试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行，各区的实验服、仪器和耗材不得混用。
设备检查：校准移液器，准备冰盒（非热启动酶需全程低温操作），检查PCR仪、离心机等设备状态，并对超净台进行紫外消毒15分钟。
试剂处理：所有试剂在使用前应于室温充分融化并震荡混匀，随后瞬时离心以去除气泡。
二、反应体系配制
| 步骤 | 操作要点 |
| 标记管子 | 使用不同标签标记PCR反应管，避免混淆 |
| 配制Master Mix | 在试剂准备区按说明书比例混合Buffer、dNTPs、引物、探针、酶等成分 |
| 分装反应液 | 将20μL荧光反应液分装至各PCR八连管中 |
三、样本与对照加入
| 类型 | 加入体积 | 作用 |
| 待测样本核酸 | 5μL | 检测目标是否存在 |
| 阴性对照 | 5μL | 排除试剂污染风险 |
| 阳性对照 | 5μL | 验证试剂有效性 |
注意：阳性对照应在标本准备区单独存放并在最后加入，防止污染。
四、上机扩增
盖紧管盖，在右上角做好标记；
放入PCR仪前震荡混匀并瞬时离心；
打开荧光定量PCR仪及其连接电脑；
设置程序（见下表）；
将PCR板放入仪器卡槽，关闭盖子；
启动运行。
典型PCR程序设置示例：
| 阶段 | 温度 | 时间 | 循环次数 |
| 初始变性 | 93–95°C | 3–5 min | 1次 |
| 循环扩增 | 93–95°C（变性） → 58–60°C（退火） → 72°C（延伸） | 40s → 30s → 60s | 30–35次 |
| 最终延伸 | 72°C | 7 min | 1次 |
注：具体参数需根据试剂盒说明书设定，不同靶标可能略有差异。
结果判读与数据分析
实验结束后，仪器自动生成扩增曲线和Ct值；
观察扩增曲线是否呈典型“S”形，判断扩增效率；
根据Ct值判断目标核酸含量——Ct值越低，初始模板量越高；
结合阴性和阳性对照结果进行综合判定，排除假阳/假阴性。
✅ 建议
- 每次实验必须设置阴性和阳性对照，以监控实验过程的可靠性；
- 所有操作佩戴手套，避免裸手接触PCR管，防止外源核酸污染；
- 实验废弃物需经无害化处理后丢弃；
- 不同批号试剂不可混用，新批次使用前建议预实验验证。
相关文章
更多 >