2025年8月7日，美国圣路易斯华盛顿大学医学院Grant A.Challen 团队在《Cell Stem Cell》期刊发表题为“Non-canonical functions of DNMT3A in hematopoietic stem cells regulate telomerase activity and genome intergrity”（DNMT3A调控造血干细胞的端粒酶活性和基因组完整性的非经典功能）的重要研究文章。

研究通过构建DNA甲基化功能丧失但蛋白结构完整的Dnmt3a点突变小鼠模型（E752A、V712G、R832A突变），结合体内外功能实验、连续骨髓移植、全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）及端粒功能分析等研究，系统揭示了DNMT3A在造血干细胞（HSC）中存在不依赖于其DNA甲基转移酶活性的非经典功能，核心结论为Dnmt3a缺失的HSC通过上调端粒酶活性、维持端粒长度并抑制DNA损伤应答（DDR），实现无限移植传代，而保留催化缺失蛋白的HSC则无法长期维持该优势。综上，这些发现阐明了DNMT3A在HSCs中具有不依赖于其经典甲基化功能的、调控端粒稳态和基因组完整性的“非经典”作用，为理解克隆性造血（CH）和白血病中DNMT3A突变的作用机制提供了全新视角。

英文标题：Non-canonical functions of DNMT3A in hematopoietic stem cells regulate telomerase activity and genome intergrity
中文标题：DNMT3A调控造血干细胞的端粒酶活性和基因组完整性的非经典功能
发表时间：2025-8-7
发表期刊：Cell Stem Cell
影响因子：IF20.4/Q1
技术平台：WGBS、RNA-seq等
作者单位：美国圣路易斯华盛顿大学医学院
DOI:10.1016/j.stem.2025.06.010

DNMT3A是造血干细胞（HSC）命运决定的关键调控因子，也是人类克隆性造血（CH）中最常突变的基因。DNMT3A作为一种DNA甲基转移酶，在先前研究中，DNMT3A功能丧失细胞仅表现出轻度DNA甲基化变化，且与基因表达变化不相关。为探索Dnmt3a在HSC中是否具有DNA甲基化非依赖性功能，研究人员构建了多个DNA甲基化功能丧失不同程度的Dnmt3a等位基因突变小鼠模型。分析结果发现，DNA甲基化功能丧失的Dnmt3a蛋白可以挽救Dnmt3a缺失型HSC的克隆扩增，表明Dnmt3a在HSC中具有重要的非经典功能。Dnmt3a缺失型HSC能够无限期移植，表明其能规避抑制HSC复制寿命的机制（如端粒缩短）。Dnmt3a缺失型HSC显示出增强的端粒酶活性，并在连续移植中维持端粒长度，揭示了DNMT3A突变在调控HSC寿命中与DNA甲基化功能无关的全新作用。

研究亮点

• 构建小鼠模型以研究Dnmt3a不依赖DNA甲基化的功能
• Dnmt3a介导的DNA甲基化对造血干细胞分化至关重要，但对自我更新并非必需
• Dnmt3a调控造血干细胞中端粒酶的表达和活性
• 在端粒酶缺失情况下，Dnmt3a影响造血干细胞中的DNA损伤应答信号

图形摘要

研究方法
（1）小鼠模型构建：

• 构建条件性敲除（Dnmt3afl/fl），催化失活点突变（催化死亡/0%甲基化活性的Dnmt3aE752A、活性30%的Dnmt3aV712G和靶标识别缺陷/20%活性的Dnmt3aR832A），Dnmt3a/Terc双敲除（DTKO）模型。

（2）造血干细胞功能学分析：

• 连续骨髓移植：评估HSCs长期自我更新和重建能力。
• 集落形成单位（CFU）实验：体外评估HSCs/祖细胞增殖功能。
• 流式细胞术分析与分选：精确分选和鉴定HSCs（Lin- Sca-1+ c-Kit+ CD48- CD150+）及其他造血细胞群体，并分析细胞凋亡（Annexin V）、细胞周期（Ki-67/DAPI）和DNA损伤（γH2AX）。

（3）分子机制分析

• 全基因组甲基化测序（WGBS）：在全基因组单碱基分辨率水平上，系统比较不同基因型HSCs和骨髓细胞的DNA甲基化图谱，是本研究核心的甲基化分析技术。
• RNA测序（RNA-seq）与qPCR：分析转录组变化和特定基因（如Tert, Terc）的表达。

（4）端粒功能分析

• 端粒限制性片段（TRF）分析：检测端粒DNA片段的大小分布，反映平均端粒长度。
• 端粒酶活性检测（TRAP法）：定量检测端粒延伸产物，定量端粒酶活性。
• 端粒荧光原位杂交（TelC FISH）：定量检测单个细胞的端粒信号强度。

（5）DNA损伤与ALT分析：

• 彗星试验分析全局DNA损伤。
• 免疫荧光共定位（53BP1/TRF1）检测端粒功能障碍诱导的灶（TIF）。
• C-circle检测和APB（ALT相关PML核体）分析评估替代性端粒延长（ALT）通路。
  （6）蛋白表达及互作分析：通过免疫共沉淀（Co-IP）研究Dnmt3a与组蛋白伴侣SPT16的相互作用。
• 蛋白质免疫印迹（Western Blot）：分析目标蛋白（如Dnmt3a, γH2AX, SPT16）的表达水平。
• 免疫共沉淀（Co-IP）：研究Dnmt3a与潜在互作蛋白（如SPT16）的互作及其药物干预下的变化。

结果图形
（1）Dnmt3a在造血中存在非DNA甲基化依赖性功能的证据
研究团队首先通过过表达实验揭示Dnmt3a存在区别于其传统甲基化酶活性的功能。由于DNMT3L（可增强Dnmt3a甲基化活性的辅助因子）在HSC中不表达，研究团队在野生型和Dnmt3a敲除（Dnmt3aKO）HSPC中分别异位表达Dnmt3L，观察到Dnmt3L仅在野生型背景下抑制移植嵌合率，而在Dnmt3aKO细胞中无影响（图1C-E），说明其功能依赖Dnmt3a。更重要的是，过表达野生型Dnmt3a对野生型和Dnmt3aKO HSPC均产生毒性，导致移植后细胞快速凋亡（图1B、F），而Dnmt3L过表达虽引起更显著的DNA高甲基化（图1G-H），却未产生同等毒性，表明Dnmt3a的某些调控作用不依赖于其催化活性。WGBS分析显示，Dnmt3a过表达仅引起轻度甲基化改变，而Dnmt3L导致数千个差异甲基化区域（DMRs）高甲基化，但表型差异却显著差异，这表明Dnmt3a功能不能简单直接等同于其甲基化活性，可能存在独立于催化的非经典功能。

图1：Dnmt3a在造血中DNA甲基化非依赖性功能的证据

（2）DNA甲基化功能丧失的Dnmt3a蛋白可挽救Dnmt3a缺失HSCs的功能变化
为直接验证非经典功能，研究者利用慢病毒在Dnmt3aKO HSC中挽救表达野生型或催化缺失型Dnmt3a点突变体（E752A、V712G、R832A）。分析结果表明，在Dnmt3aKO HSCs中挽救这些甲基化功能受损的突变蛋白，能够像挽救野生型Dnmt3a一样，抑制其增强的CFU形成能力，且所有三种催化缺陷变体同样能有效挽救CFU异常（图2A），但并未介导全基因组DNA甲基化显著增加（图2B）。这直接证明，挽救Dnmt3aKO HSCs异常增殖表型的功能，不依赖于Dnmt3a的DNA甲基化催化活性。

体内移植实验中，全骨髓细胞移植显示Dnmt3aE752A/E752A和Dnmt3aR832A/R832A HSC在二次移植后逐渐衰竭，而Dnmt3aKO HSC持续扩增（图2C-E），提示甲基化非依赖功能虽能短期调控HSC活性，但长期维持克隆优势需完全丧失Dnmt3a蛋白。

图2：DNA甲基化功能丧失的Dnmt3a蛋白挽救Dnmt3a缺失型造血干细胞的功能改变

（3）DNA甲基化缺失型Dnmt3a可挽救Dnmt3a缺失HSCs在连续移植中的克隆扩增
为在体内验证，研究团队在成年小鼠中诱导表达纯合或杂合的催化失活Dnmt3a突变蛋白（Δ/E752A, Δ/R832A）。在连续竞争性移植实验中，完全缺失Dnmt3a（Δ/Δ）的HSCs表现出经典且持续的克隆扩增优势，但在表达催化失活突变体（Δ/E752A, Δ/R832A）的HSCs中，其过度自我更新的表型被显著抑制，功能上更接近于野生型或杂合缺失（Δ/+）的HSCs（图3A-C）。这再次证明Dnmt3a调控HSCs自我更新的关键功能不依赖于其DNA甲基化活性。

值得注意的是，WGBS分析显示Dnmt3aΔ/E752A与Dnmt3aΔ/Δ细胞的甲基化谱几乎完全重叠。此结果强烈证明，HSC的长期克隆扩增优势与DNA甲基化状态（催化活性丧失）不相关，而完全依赖于Dnmt3a蛋白的缺失。细胞周期和凋亡分析排除这些差异源于增殖或存活率变化（图3D-E），证实功能差异主要归因于其内在自我更新机制变化。

图3：DNA甲基化功能丧失的Dnmt3a挽救连续移植中Dnmt3a缺失型造血干细胞的克隆扩增

（4）DNA甲基化与基因表达和功能输出不相关
研究者对来自连续移植后的不同基因型HSCs和骨髓细胞进行了单碱基分辨率的全基因组甲基化测序分析（WGBS）。分析结果显示，Dnmt3aΔ/E752A（催化失活）细胞的整体甲基化谱与Dnmt3a Δ/Δ（完全缺失）细胞几乎完全重叠，而与野生型细胞显著不同（图4A-F）。其中主成分分析（PCA）显示，在Dnmt3aKO细胞中的差异甲基化区域（DMRs），Dnmt3aΔ/E752A细胞也表现出几乎一致的甲基化水平（图4C, F）。然而，与几乎完全一致的甲基化图谱形成鲜明对比的是，这些基因型在HSC功能（自我更新）和基因表达谱上存在显著差异。RNA-seq分析显示，Δ/E752A和Δ/R832A HSCs的转录组更接近于野生型，而与Δ/Δ HSCs存在显著差异（图4G, H）。

研究通过整合WGBS与RNA-seq数据，系统论证了DNA甲基化变化不能预测HSC功能潜力，甲基化非依赖的蛋白-蛋白互作或染色质调控才是驱动表型的核心机制，为研究领域长期存在的"甲基化悖论"提供了决定性证据。

图4：造血干细胞的DNA甲基化谱与基因表达及功能输出无关

（5）DNMT3A功能丧失增强TERT表达和端粒酶活性
研究者观察到Dnmt3aKO HSCs能够进行无限期连续移植，提示其可能规避了限制HSC复制寿命的机制，研究团队聚焦端粒调控机制。TRF Southern blot分析和TelC FISH证实，Dnmt3aKO骨髓细胞和HSPCs的端粒长度显著长于对照组，且在连续移植中得以维持（图5A-C）。qPCR和TRAP实验揭示，Dnmt3aΔ/Δ细胞Tert mRNA表达增加3倍，端粒酶活性显著升高（图5D-E）。重要的是，这种端粒酶的上调也出现在催化失活的Δ/E752A和Δ/R832A HSCs中（图5G-H），并且这些细胞的端粒在短期（二次）移植后也出现延长（图5I），然而在长期移植（四次）后，E752A和R832A组端粒长度不及Dnmt3aΔ/Δ组（图5J），提示短期端粒酶激活可能依赖甲基化非直接机制（如转录调控），而长期维持需完全蛋白缺失以激活替代性端粒延长（ALT）通路。

图5：DNMT3A功能丧失会增强TERT表达和端粒酶活性

（6）Dnmt3a功能丧失可部分挽救端粒酶缺失HSCs的功能
为了探究端粒酶上调是否是Dnmt3aKO HSCs功能优势的原因，研究者构建了Dnmt3a与Terc（端粒酶RNA组分）双敲除（DTKO）小鼠。在连续移植中，单纯的TercKO HSCs由于端粒快速缩短，其重建功能急剧减弱，但DTKO HSCs的移植能力得到了显著的部分挽救（图6A-D）。

有趣的是，尽管DTKO细胞缺乏端粒酶活性（图6F），但其端粒在连续移植后仍被延长（图6E），并出现了替代性端粒延长（ALT）通路标志物C-circle和APBs（图6I-K）。这表明，在端粒酶缺失的情况下，Dnmt3a缺失能够激活ALT通路来维持端粒长度，从而部分补偿端粒酶功能。

图6：Dnmt3a功能丧失部分挽救端粒酶缺失HSCs的功能缺陷

（7）Dnmt3a缺失抑制功能失调端粒处的DNA损伤应答
端粒功能障碍会激活DNA损伤应答（DDR），导致细胞衰老或凋亡。研究发现，在TercKO HSCs中，DDR标志物γH2AX水平、端粒功能障碍诱导灶（TIF）以及凋亡均显著增加。而同时缺失Dnmt3a（DTKO）能显著抑制这些DDR信号的激活（图7A-F）。彗星试验也表明DTKO细胞的整体DNA损伤少于TercKO细胞（图7G-H）。

此外，在基因毒性药物处理下，Dnmt3aKO细胞也表现出更强的DDR抵抗，而这种抵抗在催化失活突变体（Δ/E752A, Δ/R832A）中减弱或消失（图7I）。提示Dnmt3a通过非甲基化依赖性方式整合并调控HSCs对基因毒应激（特别是端粒损伤）的DDR信号。

图7：Dnmt3a丧失抑制功能失调端粒处的DDR

结论和启示
本研究通过一系列功能实验和分子机制实验（WGBS、RNA-seq）等揭示DNMT3A除了具有经典的DNA甲基化功能外，在造血干细胞中还具有至关重要的“非经典”功能：DNMT3A可以作为端粒酶活性和端粒长度的负调控因子，并通过抑制DNA损伤反应来维护基因组完整性。DNMT3A功能缺失突变通过解除这些抑制，使HSCs获得端粒维持和抗DNA损伤的双重能力，从而驱动其克隆性扩增，这可能是其作为血液肿瘤驱动突变的核心机制。

在本研究中，DNA甲基化分析（WGBS）并非为了寻找致病性的甲基化差异，而是通过比较催化失活突变与完全敲除的甲基化图谱，排除功能差异并非源于甲基化差异，从而将研究焦点转向非甲基化机制。这是DNA甲基化乃至表观遗传学研究思路中的一个优秀案例。

参考文献：
Xavier Raj I, …et al, Challen GA. Non-canonical functions of DNMT3A in hematopoietic stem cells regulate telomerase activity and genome integrity. Cell Stem Cell. 2025 Jul 10. doi: 10.1016/j.stem.2025.06.010.